Вести

Традиционалне дијагностичке стратегије за откривање заразних болести захтевају употребу стоних инструмената који нису погодни за тестирање на месту неге (ПОЦТ).Нова микрофлуидика је високо минијатуризована, аутоматизована и интегрисана технологија која је потенцијална алтернатива традиционалним методама за брзу, јефтину и прецизну дијагностику на лицу места.Методе молекуларне дијагностике се широко користе у микрофлуидним уређајима као најефикасније методе за откривање патогена.Овај преглед резимира недавна достигнућа у молекуларној дијагностици инфективних болести заснованој на микрофлуидима и из академске и из индустријске перспективе.Прво, описујемо типичну обраду нуклеинских киселина на чипу, укључујући претходну обраду узорка, амплификацију и очитавање сигнала.Затим се пореде карактеристике, предности и мане четири типа микрофлуидних платформи.Затим ћемо разговарати о употреби дигиталних тестова за апсолутну квантификацију нуклеинских киселина.И класични и новији комерцијални уређаји за молекуларну дијагностику засновани на микрофлуидима сумирани су као доказ тренутног стања на тржишту.На крају, предлажемо будуће правце за микрофлуидну дијагностику заразних болести.
Заразне болести изазивају патогени, укључујући бактерије, вирусе и паразите, који су распрострањени широм света.За разлику од других болести, патогени се брзо инфицирају и шире између људи и животиња домаћина путем инокулације, ваздуха и воде [1].Превенција заразних болести је критична као мера јавног здравља.Три главне стратегије за борбу против заразних болести: (1) контрола извора инфекције;(2) прекид преносног пута;(3) заштита осетљивих популација.Међу главним стратегијама, контрола извора инфекције се сматра најважнијом стратегијом због своје погодности и ниске цене.Брза дијагноза, изолација и лечење инфицираних особа су критични, захтевају брзе, осетљиве и тачне дијагностичке стратегије [2].Тренутна дијагноза заразних болести обично комбинује клинички преглед заснован на знацима и симптомима и лабораторијским студијама као што су култура ћелија и молекуларна дијагностика, које захтевају обучено особље, радно интензивне процедуре и скупу опрему за тестирање [3, 4].Превенција избијања заразних болести захтева брзу, јефтину и тачну локалну дијагнозу, посебно у подручјима са ограниченим ресурсима где су заразне болести честе и тешке [5], као и лечење у дивљини или на бојном пољу, где су хитни случајеви непредвидиви..медицинска нега је ограничена [6].У овом контексту, микрофлуидика је технологија која комбинује технологије микроелектромеханичких система, нанотехнологију или науку о материјалима за прецизну манипулацију флуидима [7,8,9,10], пружајући нове могућности за детекцију на месту неге (ПОЦТ).) инфективни агенси ван болница и лабораторија.У поређењу са традиционалном дијагностиком која одузима много времена, микрофлуидна технологија нуди уштеду узорака и трошкова за молекуларну дијагностику током избијања болести.Глобално ширење корона вирусне болести 2019 (ЦОВИД-19) узроковано је тешким акутним респираторним синдромом корона вирус 2 (САРС-ЦоВ-2), па се поново истиче значај микрофлуидике за правовремену превенцију и контролу пандемије [11, 12]. , 13].За разлику од традиционалне дијагностике, микрофлуидни ПОЦТ користи мале преносиве уређаје у распону од столних анализатора до малих бочних тест трака за тестирање у близини тачке узорковања [14].Ови тестови карактеришу поједностављену припрему узорка или никакву припрему узорка, брзо појачање сигнала и осетљива очитавања сигнала што резултира кратким трајањем и прецизним резултатима у року од неколико минута.Доступност и масовна производња здравствених инструмената заснованих на микрофлуидима проширила је њихову исплативу и директну дијагностичку примену ван болнице, у близини пацијената, па чак и код куће.
Међу постојећим стратегијама дијагностиковања инфективних болести, молекуларна дијагностика је једна од најосетљивијих [15, 16].Поред тога, молекуларна дијагностика се често користи као златни стандард за континуирано откривање ЦОВИД-19, омогућавајући директно откривање региона РНК или ДНК специфичних за вирус пре почетка имуног одговора [17, 18].У овом прегледу представљамо најновија достигнућа у молекуларним дијагностичким процесима заснованим на микрофлуидима за заразне болести, од академске до будућих индустријских перспектива (Слика 1).Почећемо са три кључна корака у детекцији нуклеинске киселине: предтретман узорка на чипу, амплификација нуклеинске киселине и очитавање сигнала.Затим смо упоредили различите типове микрофлуидних платформи са њиховом структуром и функцијом, показујући јединствене карактеристике (снаге и слабости).Дигитална детекција нуклеинских киселина је даље дискутована и дата као пример технологије треће генерације за апсолутну квантификацију молекула инфективног патогена.Поред тога, биће представљено неколико типичних и најновијих комерцијалних ПОЦТ уређаја како би се приказало тренутно стање микрофлуидног ПОЦТ тржишта за молекуларну дијагностику.Такође ћемо разговарати и објаснити нашу визију за будуће апликације.
Модули микрофлуидних чипова за детекцију нуклеинских киселина могу се поделити у три категорије (узорковање, препознавање и сигнализација) према њиховим функцијама [19].Међу овим модулима, модул узорковања углавном реализује лизу узорка и екстракцију нуклеинске киселине.Сензорски модул углавном контролише конверзију и појачавање сигнала нуклеинских киселина.Модул за сигнализацију детектује сигнал конвертован и обрађен од стране сензорског модула.На основу процеса детекције нуклеинских киселина на чипу, сумираћемо различите чипове који могу да реализују функцију „улаз и излаз“.
Први корак у детекцији нуклеинске киселине је екстракција нуклеинске киселине, односно изоловање циљне нуклеинске киселине из оригиналног узорка.Екстракција нуклеинске киселине се врши ради пречишћавања нуклеинских киселина од других молекуларних загађивача, обезбеђивања интегритета примарне структуре молекула нуклеинске киселине и оптимизације резултата.Екстракција нуклеинске киселине захтева неопходну лизу узорка и хватање нуклеинске киселине, чији квалитет и ефикасност имају огроман утицај на резултате истраживања и дијагностике.Било који суптилни нежељени ефекти током екстракције могу ограничити даље откривање.На пример, методе ланчане реакције полимеразе (ПЦР) и петље изотермне амплификације (ЛАМП) су инхибиране неким резидуалним органским растварачима као што су етанол и изопропанол у реагенсима за изолацију нуклеинске киселине [20].Екстракција течност-течност и екстракција чврсте фазе су најпопуларније методе за изоловање нуклеинских киселина [21], међутим, екстракција течност-течност на чипу је изузетно ограничена, пошто реагенси који се користе у течно-течној екстракцији изазивају корозију већине микрофлуидних чипова. .Овде истичемо методе екстракције чврсте фазе засноване на микромрежу и упоређујемо њихове предности и недостатке.
Силицијум је супстратни материјал компатибилан са нуклеинским киселинама због своје биокомпатибилности, стабилности и лакоће модификације [22].Важно је да када се модификује силицијум диоксидом или другим материјалима, овај композит показује својства да адсорбује негативно наелектрисане нуклеинске киселине под ниским пХ, високим условима соли док елуира са високим пХ, ниским растворима соли.На основу овог феномена могуће је пречишћавање нуклеинске киселине.
Различити облици материјала на бази силицијум-диоксида коришћени су за екстракцију нуклеинске киселине у микрофлуидима, као што су силицијумске куглице, прашкови, филтери од микровлакана и мембране од силицијум диоксида [23, 24, 25, 26].У зависности од својстава материјала, материјали на бази силицијума могу се користити у микро круговима на различите начине.На пример, грануле силицијум диоксида, прашкови и комерцијални нанофилтери могу се једноставно ставити у поре или микроканале микрофлуидних чипова и помоћи у екстракцији нуклеинских киселина из узорака [27, 28, 29].Површински модификоване силицијумске мембране се такође могу користити за брзо пречишћавање ДНК од патогена по ниској цени.На пример, Ванг ет ал.[30] Комбиновањем реакција амплификације денатурације са разменом ланаца посредованом везикулом са силицијумским мембранама обложеним хитозанским олигосахаридима, уведен је свестрани преносиви систем који је успешно детектовао 102–108 јединица које формирају колоније.(ЦФУ)/мл Вибрио парахаемолитицус., а присуство вируса је било лако видљиво.Повелл ет ал.[31] Микромрежи на бази силицијума су затим коришћени за детекцију вируса хепатитиса Ц (ХЦВ), вируса хумане имунодефицијенције (ХИВ), Зика вируса и хуманог папилома вируса и аутоматског размножавања, у којем је развијен вијугави микрореактор од 1,3 μл за хватање РНК вируса.и врши ин ситу појачање.Поред ових метода, површински модификоване микроколоне силицијум диоксида такође играју кључну улогу у екстракцији нуклеинске киселине, пошто геометрија и својства материјала за модификовање у великој мери повећавају ефикасност екстракције.Цхен ет ал.[32] је предложио микрофлуидну платформу за изолацију РНК ниске концентрације засновану на силицијумским микроколонама обложеним амино колонама.Овај микрофлуидни уређај интегрише низ од 0,25 цм2 микростубова на силицијумској подлози како би се постигла већа ефикасност екстракције кроз дизајн високог односа површине према запремини.Предност овог дизајна је што микрофлуидни уређај може постићи ефикасност екстракције нуклеинске киселине до 95%.Ове стратегије засноване на силицијуму показују вредност брзо изолованих нуклеинских киселина по ниској цени.У комбинацији са микрофлуидним чиповима, стратегије екстракције на бази силицијума могу не само да повећају ефикасност детекције нуклеинских киселина, већ и да олакшају минијатуризацију и интеграцију аналитичких уређаја [20].
Методе магнетне сепарације користе магнетне честице за изоловање нуклеинских киселина у присуству спољашњег магнетног поља.Често коришћене магнетне честице укључују Фе3О4 или γ-Фе2О3 магнетне честице обложене силицијумом, амино и карбоксилом [33,34,35,36].Карактеристична карактеристика магнетних честица у поређењу са СПЕ методама на бази силицијума је лакоћа манипулације и контроле са спољним магнетима.
Користећи електростатичку интеракцију између нуклеинских киселина и силицијум диоксида, у условима високе соли и ниског пХ, нуклеинске киселине се адсорбују на површини магнетних честица обложених силицијумом, док се у условима ниске соли и високог пХ молекули могу опрати. опет..Магнетне перле обложене силицијумом омогућавају екстракцију ДНК из узорака велике запремине (400 μЛ) коришћењем магнетно контролисаног кретања [37].Као демонстрацију, Родригуез-Матеос ет ал.[38] је користио подесиве магнете за контролу преноса магнетних перли у различите коморе.На основу магнетних честица обложених силицијумом, 470 копија/мЛ САРС-ЦоВ-2 геномске РНК може се издвојити из узорака отпадне воде за детекцију реверзне транскрипције ЛАМП (РТ-ЛАМП) и одговор се може очитати у року од 1 сата.голим оком (сл. 2а).
Уређаји на бази магнетних и порозних материјала.Концептуални дијаграм микрофлуидног уређаја ИФАСТ РТ-ЛАМП за детекцију САРС-ЦоВ-2 РНК (прилагођено из [38]).б Центрифугални микро уређај за дСПЕ нуклеинске киселине букалног бриса (прилагођено из [39]).ц Уграђени концентратор узорака са сопственим напајањем помоћу ФТА® картице (прилагођено из [50]).д Фусион 5 филтер папир модификован хитозаном (преузето из [51]).САРС-ЦоВ-2 тешки акутни респираторни синдром коронавирус 2, РТ-ЛАМП изотермна амплификација посредована петљом реверзне транскрипције, технолошки партнери за проналажење ФТА, НА нуклеинска киселина
Позитивно наелектрисане магнетне честице су идеалне за причвршћивање фосфатне кичме нуклеинске киселине.При одређеној концентрацији соли, негативно наелектрисане фосфатне групе нуклеинских киселина могу бити позитивно наелектрисане на површини магнетних композитних честица.Због тога су развијене магнетне наночестице са храпавом површином и великом густином амино група за екстракцију нуклеинских киселина.Након магнетне сепарације и блокирања, магнетне наночестице и ДНК комплекси могу се директно користити у ПЦР-у, што елиминише потребу за сложеним и дуготрајним операцијама пречишћавања и елуирања [35].Магнетне наночестице обложене негативним карбоксилним групама су такође коришћене за одвајање нуклеинских киселина адсорбованих на површинама у високим концентрацијама полиетилен гликола и раствора натријум хлорида [36].Са овим површински модификованим магнетним перлама, екстракција ДНК је компатибилна са накнадним појачавањем.Дигнан и др.[39] описао је аутоматизовану и преносиву центрифугалну микрофлуидну платформу за предтретман нуклеинским киселинама, омогућавајући нетехничком особљу да је користи на лицу места.Поред тога, компатибилност изоловане ДНК са ЛАМП-ом, методом добром за анализу нуклеинске киселине на месту збрињавања, даље демонстрира минималне захтеве за опремом и погодност за колориметријске тестове (слика 2б).
Методе магнетних куглица нуде могућност аутоматизоване екстракције, од којих неке постоје у комерцијалним аутоматизованим екстракторима нуклеинских киселина [КингФисхер;ТхермоФисхер (Валтхам, МА, САД), КИАцубе® ХТ;ЦапиталБио (Пекинг, Кина) и Биомек®;Бекман (Мајами, САД).), Флорида, САД)].Предности комбиновања магнетних перли са микрофлуидиком могу се искористити за ефикасну аутоматизовану екстракцију нуклеинских киселина, што би потенцијално могло унапредити развој молекуларне дијагностике;међутим, комбинација магнетних перли са микрофлуидиком и даље се у великој мери ослања на сложене системе контроле за прецизну манипулацију магнетним перлама, што објашњава популарност комерцијалних производа који су гломазни и скупи, што ограничава даљу примену магнетних перли у ПОЦТ.
Неколико порозних материјала као што су модификовани нитроцелулозни филтери, картице Финдерс Тецхнологи Ассоциатес (ФТА), филтер папири на бази полиетерсулфона и материјали обложени гликаном такође су коришћени за детекцију нуклеинских киселина [40, 41, 42, 43, 44].Порозни влакнасти материјали као што је влакнасти папир су први пут коришћени за изолацију ДНК физичким преплитањем дуголанчаних молекула ДНК са влакнима.Мале поре доводе до јаког физичког ограничења молекула ДНК, што позитивно утиче на екстракцију ДНК.Због различите величине пора влакнастог папира, ефикасност екстракције не може задовољити потребе амплификације ДНК [45, 46].ФТА картица је комерцијални филтер папир који се користи у области судске медицине и широко се користи у другим областима молекуларне дијагностике.Коришћењем целулозног филтер папира импрегнираног разним хемикалијама за лизу ћелијских мембрана у узорку, ослобођена ДНК је заштићена од деградације до 2 године.Недавно је развијен импрегнирани папир од целулозе за молекуларну детекцију различитих патогена, укључујући САРС-ЦоВ-2, лајшманијазу и маларију [47,48,49].ХИВ у изолованој плазми се директно лизира, а вирусна нуклеинска киселина је обогаћена ФТА® проточном мембраном уграђеном у концентратор, што омогућава ефикасну производњу нуклеинске киселине [50] (слика 2ц).Главни проблем са детекцијом нуклеинске киселине помоћу ФТА картица је тај што хемикалије као што су гванидин и изопропанол инхибирају накнадне реакције амплификације.Да бисмо решили овај проблем, развили смо Фусион 5 хитозаном модификован филтер папир, који комбинује предности и физичког преплитања молекула ДНК и фиброзног филтер папира, и електростатичке адсорпције ДНК на хитозаном модификованим једињењима како би се постигла високоефикасна екстракција нуклеинске киселине ..филтерска влакна [51] (слика 2д).Слично, Зху ет ал.[52] су демонстрирали хитозаном модификовану ПЦР методу засновану на ин ситу капиларном микрофлуидном систему за брзу изолацију и детекцију РНК вируса Зика.Нуклеинске киселине могу бити адсорбоване/десорбоване у мешовитом лизату/ПЦР медијуму, респективно, на основу својства прекидача за укључивање/искључивање хитозана.укључено и искључено”, реагује на пХ.
Као што је горе поменуто, ове стратегије комбинују предности различитих материјала чврсте фазе и повећавају ефикасност екстракције нуклеинске киселине у микрофлуидима.У практичним применама, употреба ових материјала у великим количинама је неекономична, а правилна површинска обрада или површинска модификација уобичајених материјала са овим материјалима такође може да очува њихову функцију.Стога се верује да примена ових стратегија након пилот студије може смањити трошкове.
Тестирање нуклеинске киселине на микрофлуидним платформама често користи мале запремине узорака (< 100 µл), стога захтева појачавање циљних нуклеинских киселина са специфичним сондама за конверзију у сигнал који је погодан за детекцију низводно (оптичко, електрично и магнетно) [53, 54]. Тестирање нуклеинске киселине на микрофлуидним платформама често користи мале запремине узорака (< 100 µл), стога захтева појачавање циљних нуклеинских киселина са специфичним сондама за конверзију у сигнал који је погодан за детекцију низводно (оптичко, електрично и магнетно) [53, 54]. При тестирању нуклеиновие кислоти на микрожидкостних платформах често используетса небольшие объеми образов (< 100 мкл), зато се захтева амплификациа целевих нуклеинових кислоти с помосьу специальних зондов дла преобразованиа в сигнал, удобниј дла последуусего откривениа (оптического, електрического и магнетного) [53, 54]. Приликом тестирања нуклеинских киселина на микрофлуидним платформама, често се користе мале запремине узорака (<100 µЛ), тако да је потребно појачавање циљне нуклеинске киселине посебним сондама да би се она претворила у сигнал погодан за накнадну детекцију (оптичку, електричну и магнетну) [53, 54].微流控 平台 的 核酸 检测 通常 检测 检测 (<100 μЛ), 因此 需要 使用 特定 探针 扩增 目标 目标, 以 转换 为 便于 下游 (光学, 电学 和 磁学) 的 信号 [53, 54 ]。微流控 平台 的 核酸 检测 使用 使用 使用 (<100 μл), 因此 需要 特定 探针 扩增, 以 转换 为 下游 下游 (光学, 电学 磁学) 的 信号 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновие кислоти на микрожидкостних платформах обично использует небольшие объеми образов (<100 мкл), что захтева амплификацију целевих нуклеинових кислотов с помосьу специальних зондов дла преобразованиа в сигнали дла последуусего откривениа (оптического, електрического и магнетного) [53, 54]]. Детекција нуклеинских киселина на микрофлуидним платформама обично користи мале запремине узорака (<100 μл), што захтева појачавање циљних нуклеинских киселина специјалним сондама да би се они претворили у сигнале за накнадну детекцију (оптичке, електричне и магнетне) [53, 54]] .Амплификација нуклеинске киселине у микрофлуидици такође може убрзати реакције, оптимизовати границе детекције, смањити захтеве за узорком и побољшати тачност детекције [55, 56].Последњих година, са реализацијом брзе и прецизне детекције, у микрофлуидици су примењене различите методе амплификације нуклеинских киселина, укључујући ПЦР и неке изотермне реакције амплификације.Овај одељак ће сумирати методе за детекцију нуклеинске киселине засноване на микрофлуидним системима.
ПЦР је симулација процеса репликације ДНК организма, чија је теорија детаљно описана на другом месту и неће се овде расправљати.ПЦР може да појача веома малу количину циљне ДНК/РНА експоненцијалном брзином, чинећи ПЦР моћним алатом за брзо откривање нуклеинских киселина.Последњих деценија развијени су многи преносиви микрофлуидни уређаји опремљени ПЦР термалним циклусним системима да задовоље потребе дијагностике на лицу места [57, 58].ПЦР на чипу се може поделити у четири типа (конвенционални, континуирани проток, просторно комутирани и конвективни ПЦР) према различитим методама контроле температуре [59].На пример, Гее ет ал.[60] развили су квантитативну ПЦР методу директне реверзне транскрипције (РТ-кПЦР) на сопственој микрофлуидној платформи за мултиплексну детекцију САРС-ЦоВ-2, вируса грипа А и Б у узорцима бриса грла (слика 3а).Парк и др.[61] је направио једноставан чип за анализу патогена интеграцијом танкослојног ПЦР-а, електрода и микрофлуидног модула базираног на полидиметилсилоксану са прстима.Међутим, оба рада оличавају заједничке недостатке конвенционалног ПЦР-а.ПЦР захтева термички циклус, што ограничава даљу минијатуризацију уређаја и смањује време тестирања.
Развој микрофлуидног ПЦР-а заснованог на континуираном протоку и ПЦР са комутацијом простора је кључан за решавање овог проблема.Коришћењем дугог серпентинастог канала или кратког правог канала, ПЦР са континуираним протоком може да обезбеди брзо појачање активним циркулацијом реагенса у три зоне претходног загревања помоћу пумпе ван чипа.Овом операцијом се успешно избегава прелазна фаза између различитих реакционих температура и на тај начин значајно смањује време тестирања [62] (слика 3б).У другој студији Јунга и сар.[63] предложио је нови ротациони ПЦР генетски анализатор који комбинује карактеристике фиксне и проточне ПЦР за ултрабрзу и мултиплексну реверзну транскрипциону ПЦР (слика 3ц).За амплификацију нуклеинске киселине, ПЦР микрочип ће се ротирати кроз три грејна блока на различитим температурама: 1. Денатурациони блок 94°Ц, 2. Блок жарења на 58°Ц, 3. Блок експанзије на 72°Ц.
Примена ПЦР у микрофлуидици.Шематски приказ дирРТ-кПЦР на микрофлуидној платформи (прилагођено из [60]).б Шематски приказ континуалног протока ПЦР микромрежа заснованог на серпентинском каналу (прилагођено из [62]).ц Шематски приказ ротационог ПЦР генетског анализатора, који се састоји од микрочипа, три грејна блока и корачног мотора (прилагођено из [63]).д Дијаграм термоконвекцијске ПЦР са центрифугирањем и подешавањем (прилагођено из [64]).ДирРТ-кПЦР, ланчана реакција полимеразе директне квантитативне реверзне транскрипције
Користећи капиларе и петље или чак танке плоче, конвекцијски ПЦР може брзо да амплифицира нуклеинске киселине природном слободном термалном конвекцијом без потребе за екстерном пумпом.На пример, микрофлуидна платформа са цикличним олефинским полимером развијена је на фабрикованом ротирајућем степену загревања који користи термички циклус са центрифугирањем у микроканалу ПЦР петље [64] (слика 3д).Реакциони раствор се покреће топлотном конвекцијом, која континуирано размењује високу и ниску температуру у микроканалу са прстенастом структуром.Цео процес амплификације може да се заврши за 10 минута са границом детекције од 70,5 пг/канал.
Као што се и очекивало, брзи ПЦР је моћан алат за потпуно интегрисане системе за молекуларну дијагностику и мултиплексну анализу одговора на узорак.Брзи ПЦР значајно смањује време потребно за откривање САРС-ЦоВ-2, што доприноси ефикасној контроли пандемије ЦОВИД-19.
ПЦР захтева сложен термички циклус који није погодан за ПОЦТ.У новије време, технике изотермне амплификације су примењене на микрофлуидику, укључујући, али не ограничавајући се на ЛАМП, амплификацију полимеразе рекомбиназе (РПА) и амплификацију засновану на секвенцама нуклеинских киселина [65,66,67,68].Са овим техникама, нуклеинске киселине се појачавају на константној температури, олакшавајући стварање јефтиних, високо осетљивих преносивих ПОЦТ уређаја за молекуларну дијагностику.
ЛАМП тестови засновани на микрофлуидима високог протока омогућавају вишеструко откривање заразних болести [42, 69, 70, 71].У комбинацији са центрифугалним микрофлуидним системом, ЛАМП може додатно олакшати аутоматизацију детекције нуклеинске киселине [69, 72, 73, 74, 75].Спи-анд-реацт СлипЦхип је развијен за визуелну детекцију више паралелних бактерија коришћењем ЛАМП-а [76] (слика 4а).Када се користи оптимизована ЛАМП у тесту, однос флуоресценције сигнал-шум је био приближно 5 пута, а граница детекције је достигла 7,2 копије/μл геномске ДНК. Штавише, постојање пет уобичајених дигестивних бактеријских патогена, укључујући Бациллус цереус, Есцхерицхиа цоли, Салмонелла ентерица, Вибрио флувиалис и Вибрио парахаемолитицус, визуелизовано је на основу методе за < 60 мин. Штавише, постојање пет уобичајених дигестивних бактеријских патогена, укључујући Бациллус цереус, Есцхерицхиа цоли, Салмонелла ентерица, Вибрио флувиалис и Вибрио парахаемолитицус, визуелизовано је на основу методе за < 60 мин.Штавише, присуство пет уобичајених бактеријских патогена дигестивног тракта, укључујући Бациллус цереус, Есцхерицхиа цоли, Салмонелла ентерица, Вибрио флувиалис и Вибрио парахаемолитицус, визуелизовано је овом методом за мање од 60 минута.此外, 基于 该 在 在 <60 分钟 内 视化 视化 五 五 种 消化道 消化道 原体 的, 包括 蜡状, 大 肠杆菌, 肠 沙门 氏 菌, 河流 弧菌 和 副溶血性 弧菌.此外, 基于 该 在 在 <60 分钟 内 了 了 种 种 常见 细菌病 的 存在, 包括 芽孢杆菌, 大 肠, 肠 氏 菌, 弧菌 和 副溶血 性 ... 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 ХИППоред тога, присуство пет уобичајених бактеријских гастроинтестиналних патогена, укључујући Бациллус цереус, Есцхерицхиа цоли, Салмонелла ентерица, Вибрио флувиус и Вибрио парахаемолитицус, визуелизовано је коришћењем ове методе за мање од 60 минута.
Предности ЛАМП-а у микрофлуидици укључују, између осталог, брзу реакцију и минијатуризовану детекцију.Међутим, због реакционе температуре (око 70°Ц), аеросоли се неизбежно стварају током ЛАМП-а, што резултира великом стопом лажно позитивних резултата.Специфичност анализе, дизајн прајмера и контрола температуре такође треба да буду оптимизовани за ЛАМП.Поред тога, дизајни чипова који имплементирају вишеструку детекцију циљева на једном чипу су од велике вредности и требало би да се развијају.Поред тога, ЛАМП је погодан за вишенаменску детекцију интегрисану у један чип, што је од велике важности, али још увек има пуно простора за развој.
Висока стопа лажно позитивних ЛАМП-а може се делимично смањити са РПА, пошто релативно ниска температура реакције (~37 °Ц) доводи до релативно малог броја проблема са испаравањем [77].У систему РПА, два супротна прајмера покрећу синтезу ДНК везивањем за рекомбиназу и амплификација се може завршити у року од 10 минута [78,79,80,81].Стога је цео РПА процес много бржи од ПЦР-а или ЛАМП-а.Последњих година се показало да микрофлуидна технологија додатно побољшава брзину и тачност РПА [82,83,84].На пример, Лиу ет ал.[85] развио је микрофлуидни интегрисани тест амплификације рекомбиназе полимеразе бочног тока за брзо и осетљиво откривање САРС-ЦоВ-2 интеграцијом РПА реверзне транскрипције (РТ-РПА) и универзалног система за детекцију тест трака са бочним протоком.у јединствен микрофлуидни систем.Слика 4б).Граница детекције је 1 копија/µл или 30 копија/узорак, а детекција се може завршити за око 30 минута.Конг ет ал.развили су микрофлуидни уређај који се може носити.[86] користио је телесну температуру и систем за детекцију флуоресценције заснован на мобилном телефону да брзо и директно детектује ХИВ-1 ДНК користећи РПА (слика 4ц).Носиви РПА тест детектује 100 копија/мЛ циљне секвенце у року од 24 минута, што показује велики потенцијал за брзу дијагнозу новорођенчади инфициране ХИВ-1 у окружењима са ограниченим ресурсима.
Изотермно појачање у тестирању на лицу места (ПОЦТ).Развој и производња спина и реакционог СлипЦхип-а.Након плазма заваривања, горњи и доњи чипови су састављени са сетом навртки да би се формирао коначни чип (прилагођено из [76]).б Шема МИ-ИФ-РПА система за откривање ЦОВИД-19 (прилагођено из [85]).ц Шема носивог РПА теста за брзо откривање ХИВ-1 ДНК (прилагођено из [86]).СЕ Салмонелла ентерица, ВФ Вибрио флувиус, ВП Вибрио парахаемолитицус, БЦ Бациллус цереус, ЕЦ Есцхерицхиа цоли, ФАМ карбоксифлуоресцеин, вирус хумане имунодефицијенције ХИВ, РПА рекомбиназа полимераза амплификација, ЛЕД диода која емитује светлост, МИ-ИФ Интег. Амплифицатион
РПА заснован на микрофлуидима се брзо развија, међутим, трошкови производње чипова и потрошња реакција су превисоки и морају се смањити да би се повећала доступност ове технологије.Поред тога, висока осетљивост РПА може утицати на амплификацију неспецифичних производа, посебно у присуству контаминације.Ова ограничења могу утицати на примену РПА у микрофлуидним системима и заслужују даљу оптимизацију.Такође су потребни добро дизајнирани прајмери ​​и сонде за различите мете да би се побољшала изводљивост микрофлуидних стратегија заснованих на РПА у ПОЦТ.
Цас13 и Цас12а имају способност да насумично цепају нуклеинске киселине и стога се могу развити као алати за детекцију и дијагностику.Цас13 и Цас12а се активирају након везивања за циљну ДНК или РНК, респективно.Једном активиран, протеин почиње да цепа друге оближње нуклеинске киселине, након чега РНК за вођење које циљају нуклеинске киселине специфичне за патогене могу да цепају угашене флуоресцентне сонде и ослобађају флуоресценцију.На основу ове теорије, Келлнер ет ал.[87] је развио метод заснован на Цас13 [Специфиц Хигх-сенситивити Ензиматиц Репортер УнЛОЦКИНГ (СХЕРЛОЦК)], а Броугхтон ет ал.[88] је развио други приступ заснован на Цас12а [ЦРИСПР Транс Репортер таргетинг ДНК ендонуцлеасе (ДТЕЦР)].
Последњих година појавиле су се различите методе за детекцију нуклеинских киселина засноване на ЦРИСПР [89, 90].Конвенционалне методе засноване на ЦРИСПР-у су често дуготрајне и радно интензивне због вишеструких процедура укључујући екстракцију нуклеинске киселине, амплификацију и ЦРИСПР детекцију.Излагање течности ваздуху може повећати шансе за лажно позитивне резултате.Имајући у виду горе наведено, системима заснованим на ЦРИСПР-у је преко потребна оптимизација.
За апликације детекције ЦРИСПР-Цас12а и ЦРИСПР-Цас13а развијена је пнеуматски контролисана микрофлуидна платформа која може да изврши 24 анализе паралелно [91].Систем је опремљен уређајем за детекцију флуоресценције који заобилази амплификацију нуклеинске киселине и аутоматски детектује фемтомоларне узорке ДНК и РНК.Цхен ет ал.[92] интегрисана амплификација рекомбиназе са системом ЦРИСПР-Цас12а у центрифугалној микрофлуидици (слика 5а).Овај рад превазилази потешкоће интеграције ова два процеса јер Цас12а може пробавити ДНК гласника и инхибирати процес амплификације.Поред тога, Цхен ет ал.[92] додатно су претходно ускладиштили реагенсе у центрифугалној микрофлуидној контроли да би се цео процес аутоматски завршио.У другом раду, Силва ет ал.[93] је развио дијагностичку методу без ЦРИСПР/Цас12а амплификације и паметни телефон за откривање САРС-ЦоВ-2 (слика 5б).Овај тест, познат као систем без амплификације заснован на мобилном телефону, укључује ензим зависан од ЦРИСПР/Цас који се заснива на визуализацији паметног телефона сигнала мехурића генерисаних каталазом у микрофлуидним каналима.Осетљива детекција мање од 50 копија/µл нуклеинске киселине без претходног појачавања, цео процес од убризгавања узорка до очитавања сигнала траје само 71 минут.
Методе детекције нуклеинских киселина засноване на ЦРИСПР-у.Центрифугални ПОЦТ за интегрисану молекуларну дијагностику засновану на ЦРИСПР-у (преузето из [92]).б Развој ЦАСЦАДЕ теста за анализу САРС-ЦоВ-2 засновану на паметном телефону (прилагођено из [93]).РАА рекомбиназа амплификација, ПАМ суседни протоспацер мотив, ЦРИСПР групирани кратки палиндромски понављања у редовним интервалима, ЦАСЦАДЕ систем без појачања мобилног телефона са ензимима зависним од ЦРИСПР/ЦАС, 1-етил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид хидрохлорид ЕДЦ
Као последњи корак у детекцији нуклеинске киселине, детекција сигнала директно одражава дијагностичке резултате и представља критичан фактор у развоју ефикасног, осетљивог и тачног ПОЦТ.Сигнали се могу очитати коришћењем различитих метода као што су флуоресцентне, електрохемијске, колориметријске и магнетне стратегије.У овом одељку описујемо образложење сваког приступа и упоређујемо молекуларну дијагностику заразних болести у микрофлуидици.
Стратегије засноване на флуоресценцији се широко користе за ПОЦТ дијагностику инфективних болести због својих изузетних предности одличне осетљивости, ниске цене, лакоће рада и анализе на месту збрињавања [94, 95].Ове стратегије користе обележене флуорофоре као што су флуоресцентне боје и наноматеријали за стварање сигнала који се може детектовати (појачавање или гашење флуоресценције).Овај налаз сугерише да се стратегије засноване на флуоресценцији могу поделити на директно флуоресцентно обележавање, флуоресцентну детекцију укљученог сигнала и детекцију искљученог сигнала [96].Директна флуоресцентна детекција користи посебне флуоресцентне ознаке за обележавање специфичних лиганада који генеришу одређену количину флуоресценције када се селективно везују за мету.За детекцију флуоресценције на основу сигнала, квалитет флуоресцентног сигнала је позитивно повезан са величином од интереса.Интензитет флуоресценције је занемарљив у одсуству мете и може се детектовати када је присутна довољна количина мете.Супротно томе, интензитет флуоресценције детектован флуоресценцијом „искљученог сигнала“ је обрнуто пропорционалан количини мете, у почетку достижући максималну вредност и постепено опадајући како се циљ повећава.На пример, користећи механизам транс-цепања који зависи од циља ЦРИСПР-Цас13а, Тиан ет ал.[97] развили су нову стратегију препознавања за откривање РНК које директно заобилазе реверзну транскрипцију (слика 6а).Након везивања за комплементарне циљне РНК, ЦРИСПР-Цас13-РНА комплекс се може активирати, изазивајући трансколатерално цепање неспецифичним репортерским РНК.Флуоресцентно обележени репортер [флуорофор (Ф)] се гаси помоћу гаситеља (К) нетакнут и флуоресцира када га цепа активирани комплекс.
Предност електрохемијске детекције је велика брзина детекције, лака производња, ниска цена, лако ношење и аутоматска контрола.То је моћна аналитичка метода за ПОЦТ апликације.На основу транзистора са ефектом поља графена Гао ет ал.[98] су развили нанобиосензор за мултиплексну детекцију антигена Лајмске болести из бактерије Боррелиа бургдорфери са границом детекције од 2 пг/мЛ (слика 6б).
Колориметријски тестови су коришћени у ПОЦТ апликацијама, а имају користи од предности преносивости, ниске цене, лакоће припреме и визуелног очитавања.Колориметријска детекција може да користи оксидацију пероксидазе или наноматеријала сличних пероксидази, агрегацију наноматеријала и додавање индикаторских боја за претварање информација о присуству циљних нуклеинских киселина у видљиве промене боје [99, 100, 101].Посебно, наночестице злата се широко користе у развоју колориметријских стратегија, а због њихове способности да изазову брзе и значајне промене боје, све је веће интересовање за развој ПОЦТ колориметријских платформи за ин ситу дијагнозу заразних болести [102].Са интегрисаним центрифугалним микрофлуидним уређајем [103], патогени који се преносе храном у узорцима контаминираног млека могу се аутоматски детектовати на нивоу од 10 бактеријских ћелија, а резултати се могу визуелно очитати у року од 65 минута (слика 6ц).
Технике магнетног сенсинга могу прецизно открити аналите помоћу магнетних материјала, а последњих деценија постоји значајно интересовање за ПОЦТ апликације.Технике магнетног сенсинга имају неке јединствене предности као што су јефтини магнетни материјали, а не скупе оптичке компоненте.Међутим, употреба магнетног поља побољшава ефикасност детекције и смањује време припреме узорка [104].Поред тога, резултати магнетног сондирања показују високу специфичност, осетљивост и висок однос сигнал-шум због незнатног магнетног позадинског сигнала биолошких узорака [105].Шарма и др.интегрисао биосензор заснован на магнетном тунелском споју у преносиву микрочип платформу.[106] за мултиплексно откривање патогена (слика 6д).Биосензори осетљиво откривају субнаномоларне нуклеинске киселине изоловане од патогена.
Типичан метод детекције сигнала.Концепт хиперлокализоване детекције Цас13а (прилагођено из [97]).б Графенски нанобиосензор ФЕТ у комбинацији са Лиме ГроЕС сцФв (прилагођено из [98]).ц Колориметријске индикације за мултиплексну детекцију патогена који се преносе храном у центрифугалном микрофлуидном чипу: узорци бр. 1 и бр. 3 са циљним патогенима и узорци бр. 2, бр. 4 и бр. 5 без циљних патогена (прилагођено из [103]) .д Биосензор заснован на магнетном тунелском споју, укључујући платформу, уграђени појачивач за блокирање, контролну јединицу и напајање за генерисање/аквизицију сигнала (прилагођено из [106]).ГФЕТ Грапхене ФЕТ, Есцхерицхиа цоли, Есцхерицхиа цоли, Салмонелла типхимуриум, Вибрио парахаемолитицус, Вибрио парахаемолитицус, Листериа моноцитогенес, ПЦ ПЦ, ПДМС диметикон, ПММА полиметил метакрилат
Упркос одличним карактеристикама горе наведених метода детекције, они и даље имају недостатке.Ове методе су упоређене (табела 1), укључујући неке апликације са детаљима (за и против).
Са развојем микрофлуидике, микроелектромеханичких система, нанотехнологије и науке о материјалима, употреба микрофлуидних чипова за откривање заразних болести стално напредује [55,96,107,108].Прецизна манипулација минијатурном опремом и течностима доприноси дијагностичкој тачности и исплативости.Због тога, за даљи развој, уложени су напори да се оптимизују и надограде чипови, што је резултирало различитим микрофлуидним чиповима са различитим структурама и функцијама.Овде укратко представљамо неколико уобичајених типова микрофлуидних платформи и упоређујемо њихове карактеристике (за и против).Поред тога, већина доле наведених примера фокусира се првенствено на борбу против САРС-ЦоВ-2.
ЛОЦЦ су најчешћи минијатуризовани сложени аналитички системи и њихове операције су веома минијатуризоване, интегрисане, аутоматизоване и паралелизоване од убризгавања и припреме узорка, контроле протока и детекције течности [109, 110].Течностима се манипулише кроз пажљиво дизајнирану геометрију и интеракцију многих физичких ефеката као што су градијенти притиска, капиларно деловање, електродинамика, магнетна поља и акустични таласи [111].ЛОЦЦ показује одличне предности у високопропусном скринингу и вишеструкој детекцији, са великом брзином анализе, малом величином узорка, малом потрошњом енергије и високом ефикасношћу управљања и рада;међутим, ЛОЦЦ уређаји су веома деликатни, и производња, паковање и повезивање.Међутим, мултиплексирање и поновна употреба суочавају се са огромним потешкоћама [96].У поређењу са другим платформама, ЛОЦЦ има јединствене предности у смислу максималне разноврсности апликација и најбоље компатибилности технологије, али су и његови недостаци очигледни, односно висока сложеност и лоша поновљивост.Зависност од екстерних пумпи, које су често гломазне и скупе, додатно ограничава њихову употребу у ПОЦТ.
Током избијања ЦОВИД-19, ЛОЦЦ је добио велику пажњу.Истовремено, постоји неколико нових чипова који комбинују неколико технологија.На пример, паметни телефони се сада широко користе као преносиви уређаји за анализу и имају велики потенцијал за ЛОЦЦ интеграцију.Сун ет ал.[21] је направио микрофлуидни чип који омогућава мултиплексирање специфичних секвенци нуклеинских киселина пет патогена, укључујући САРС-ЦоВ-2, користећи ЛАМП и анализирао их помоћу паметног телефона у року од 1 сата након завршетка реакције.Као други пример, Сундах ет ал.[112] креирао је молекуларни прекидач [каталитичко појачање помоћу прекидача молекуларног прелазног стања (ЦАТЦХ)] за директно и осетљиво откривање САРС-ЦоВ-2 РНК циљева помоћу паметних телефона. ЦАТЦХ је компатибилан са преносивим ЛОЦЦ-ом и постиже супериорне перформансе (приближно 8 копија РНК/μл; < 1 х на собној температури) [112]. ЦАТЦХ је компатибилан са преносивим ЛОЦЦ-ом и постиже супериорне перформансе (приближно 8 копија РНК/μл; < 1 х на собној температури) [112]. ЦАТЦХ совместим с портативним ЛОЦЦ и обезбедует супериорну производность (примерно 8 копиј РНК/мкл; < 1 ч при комнатној температури) [112]. ЦАТЦХ је компатибилан са преносивим ЛОЦЦ-ом и обезбеђује одличан проток (приближно 8 копија РНК/µл; < 1 х на собној температури) [112]. ЦАТЦХ 与便携式ЛОЦЦ 兼容并具有卓越的性能（大约8 РНА 拷贝/μл；室温下< 1 小贝/μл；室温下< 1 小112）む[1时） ЦАТЦХ 与便携式ЛОЦЦ 兼容并具有卓越的性能（大约8 РНА 拷贝/μл；室温下< 1 小贝/μл；室温下< 1 小112）む[1时） ЦАТЦХ совместим с портативними ЛОЦЦ и предоставлает супериорну производительность (примерно 8 копиј РНК/мкл; < 1 часа при комнатној температури) [112]. ЦАТЦХ је компатибилан са преносивим ЛОЦЦ-има и има одличне перформансе (приближно 8 копија РНК/µл; < 1 сат на собној температури) [112].Поред тога, ЛОЦЦ уређаји за молекуларну дијагностику такође користе неке покретачке силе као што су вакуум, истезање и електрична поља.Канг ет ал.[113] демонстрирао је у реалном времену, ултра-брзи ПЦР наноплазма на чипу за брзу и квантитативну дијагнозу ЦОВИД-19 на терену користећи вакуумски плазмонски течни ПЦР чип.Ли ет ал.[114] је касније развио микрофлуидни чип који је покретан растезањем и који је омогућио дијагнозу ЦОВИД-19.Платформа користи РТ-ЛАМП систем појачања да одреди да ли је узорак квалитативно позитиван или негативан.Након тога, Рамацхандран ет ал.[115] су постигли одговарајуће градијенте електричног поља коришћењем изотахофорезе (ИТП), технике селективног фокусирања јона примењене у микрофлуидици.Са ИТП, циљна РНК из сирових узорака назофарингеалног бриса може се аутоматски пречистити.Затим Рамацхандран и др.[115] Комбиновањем овог пречишћавања ИТП-а са ЛАМП и ЦРИСПР тестовима побољшаним ИТП-ом откривен је САРС-ЦоВ-2 у хуманом назофарингеалном брису и клиничким узорцима за око 35 минута.Поред тога, стално се појављују нове идеје.Јадхав и др.[116] је предложио дијагностичку шему засновану на површински побољшаној Раманској спектроскопији у комбинацији са микрофлуидним уређајем који садржи или вертикално оријентисане угљеничне наноцеви обложене златом/сребром или микро/наноцеви за једнократну употребу.Уграђени филтерски микроканали са мембраном функционализовани су за једнократну употребу.Уређај адсорбује вирусе из различитих телесних течности/ексудата као што су пљувачка, назофаринкс и сузе.Дакле, титар вируса је обилан и вирус се може прецизно идентификовати Рамановим потписом.
ЛОАД је центрифугална микрофлуидна платформа у којој се сви процеси контролишу фреквенцијским протоколом који ротира микроструктурирани супстрат [110].Уређај ЛОАД карактерише коришћење центрифугалне силе као важне покретачке силе.Течности су такође подложне капиларним, Ојлеровим и Кориолисовим силама.Користећи уређај за центрифугу, анализе се изводе у континуалном течном раду од радијалног положаја према унутра ка споља, елиминишући потребу за додатним спољним цевима, пумпама, актуаторима и активним вентилима.Укратко, једна метода контроле поједностављује рад.Силе које делују на течност у истом микрофлуидном каналу на истој удаљености од центра оптерећења су једнаке, што омогућава понављање структуре канала.Дакле, ЛОАД опрема је једноставнија и економичнија за пројектовање и производњу од конвенционалне ЛОЦЦ опреме, док су реакције у великој мери независне и паралелне;међутим, због високе механичке чврстоће центрифугалне опреме, расположиви материјал чипова је ограничен и мале запремине су тешке.до аутомобила.Истовремено, већина ЛОАД уређаја је дизајнирана само за једнократну употребу, што је скупо за детекцију великих размера [96, 117, 118, 119].
Последњих деценија, ЛОАД, који се сматра једним од најперспективнијих микрофлуидних уређаја, добио је значајну пажњу истраживача и произвођача.Тако је ЛОАД стекао широку прихваћеност и користио се за молекуларну дијагностику инфективних патогена [120, 121, 122, 123, 124], посебно током избијања ЦОВИД-19.На пример, крајем 2020. Ји и др.[60] су демонстрирали директан РТ-кПЦР тест за брзо и аутоматизовано паралелно откривање САРС-ЦоВ-2 и инфекција грипом А и Б у узорцима бриса грла.Затим Ксионг ет ал.[74] представио је ЛАМП интегрисану дискоидну микрофлуидну платформу за брзо, прецизно и истовремено откривање седам хуманих респираторних коронавируса, укључујући САРС-ЦоВ-2, у року од 40 минута.Почетком 2021. де Оливеира и др.[73] је демонстрирао центрифугални микрофлуидни чип од полистиренског тонера, којим се ручно управља помоћу ротатора врха прста, за РТ-ЛАМП молекуларну дијагнозу ЦОВИД-19.Након тога, Дигнан ет ал.[39] је представио аутоматизовани преносиви микроуређај за центрифугирање за пречишћавање САРС-ЦоВ-2 РНК директно из букалних брисева.Медвед и др.[53] је предложио уграђени систем за узорковање аеросола САРС-ЦоВ-2 са ротирајућим микрофлуидним флуоресцентним чипом мале запремине са границом детекције од 10 копија/μЛ и минималним прагом циклуса од 15 минута.Суарез и др.[75] је недавно известио о развоју интегрисане модуларне центрифугалне микрофлуидне платформе за директну детекцију САРС-ЦоВ-2 РНК у узорцима назофарингеалних брисева инактивираних топлотом користећи ЛАМП.Ови примери показују велике предности и обећања ЛОАД-а у молекуларној дијагностици ЦОВИД-19.
Године 1945. Муллер и Цлегг [125] први су представили микрофлуидне канале на папиру користећи филтер папир и парафин.Године 2007. група Вхитесидес [126] створила је прву функционалну папирну платформу за тестирање протеина и глукозе.Папир је постао идеалан супстрат за микрофлуидику.Папир има инхерентна својства као што су хидрофилност и порозна структура, одлична биокомпатибилност, мала тежина, флексибилност, савитљивост, ниска цена, лакоћа употребе и практичност.Класични µПАД се састоје од хидрофилних/хидрофобних структура изграђених на папирним подлогама.У зависности од тродимензионалне структуре, μПАД-ови се могу поделити на дводимензионалне (2Д) и тродимензионалне (3Д) μПАД-ове.2Д µПАД-ови се производе формирањем хидрофобних граница за формирање микрофлуидних канала, док се 3Д µПАД-ови обично праве од наслаганих слојева 2Д микрофлуидног папира, понекад савијањем папира, техникама клизања, отвореним каналима и 3Д штампањем [96].Водене или биолошке течности на μПАД-у се првенствено контролишу капиларном силом без спољног извора напајања, олакшавајући претходно складиштење реагенса, руковање узорцима и мултиплекс детекцију.Међутим, прецизна контрола протока и детекција мултиплекса су отежани недовољном брзином детекције, осетљивошћу и поновном употребом [96, 127, 128, 129, 130].
Као необична микрофлуидна платформа, μПАД је широко промовисан и развијен за молекуларну дијагнозу заразних болести као што су ХЦВ, ХИВ и САРС-ЦоВ-2 [131, 132].За селективну и осетљиву детекцију ХЦВ-а, Тенгам ет ал.[133] развио је нови биосензор заснован на флуоресцентном папиру користећи високо специфичну сонду нуклеинске киселине на бази пиролидинил пептида.Нуклеинске киселине се ковалентно имобилишу на делимично оксидованом целулозном папиру редуктивном алкилацијом између амино група и алдехидних група, а детекција се заснива на флуоресценцији.Ови сигнали се могу очитати помоћу специјално направљеног гаџета са преносивом флуоресцентном камером у комбинацији са камером мобилног телефона.Након тога, Лу ет ал.[134] дизајнирао је флексибилну електроду засновану на папиру засновану на композитима органометалног оквира наночестица никла/злата/карбонских наноцеви/поливинил алкохола за детекцију ХИВ мета хибридизацијом ДНК користећи метилен плаво као ДНК редокс индикатор.Недавно су Цховдури ет ал.[135] је представио хипотетички дизајн платформе за µПАД тестирање на месту неге коришћењем сирове пљувачке пацијената у комбинацији са ЛАМП-ом и преносивом технологијом снимања за детекцију аналита ЦОВИД-19.
Тестови бочног протока воде течности помоћу капиларних сила и контролишу кретање течности према квашењу и карактеристикама порозних или микроструктурираних подлога.Уређаји за бочни проток се састоје од узорка, коњугата, инкубатора и детектора и упијајућих јастучића.Молекули нуклеинске киселине у ЛФА препознају специфична везива која су претходно ускладиштена на месту везивања и везују се као комплекси.Како течност пролази кроз плоче за инкубацију и детекцију, комплекси се хватају молекулима за хватање који се налазе на тест и контролним линијама, показујући резултате који се могу очитати директно голим оком.Обично се ЛФА може завршити за 2-15 минута, што је брже од традиционалног открића.Због посебног механизма, ЛФА захтева мало операција и не захтева додатну опрему, што га чини веома једноставним за коришћење.Лако се производи и минијатурише, а цена подлога на бази папира је нижа.Међутим, користи се само за квалитативну анализу, а квантитативна детекција је веома тешка, а способност мултиплексирања и проток су веома ограничени, а истовремено се може детектовати само једна довољна нуклеинска киселина [96,110,127].
Иако је већина примена ЛФА фокусирана на имунотестове, употреба ЛФА за молекуларну дијагностику у микрофлуидним чиповима је такође ефикасна и популарна [136].У случају вируса хепатитиса Б, ХИВ-а и САРС-ЦоВ-2 ЛФА Гонг ет ал.[137] је предложио ЛФА платформу наночестица са повећаном конверзијом и показао свестраност ове минијатуризоване и преносиве платформе кроз осетљиву и квантитативну детекцију вишеструких мета као што је ХБВ нуклеинска киселина.Поред тога, Фу ет ал.[138] демонстрирао је нови ЛФА заснован на површински побољшаној Раманској спектроскопији за квантитативну анализу ХИВ-1 ДНК при ниским концентрацијама.За брзо и осетљиво откривање САРС-ЦоВ-2, Лиу ет ал.[85] је развио микрофлуидну интегрисану РПА анализу бочног тока комбиновањем РТ-РПА и универзалног система за детекцију бочног протока у један микрофлуидни систем.
Примена различитих микрофлуидних платформи варира у зависности од специфичних студија, користећи све предности могућности и предности платформи.Са приступачним вентилима, пумпама и каналима, ЛОЦЦ је најсвеобухватнија платформа за разноврсност апликација и интероперабилност са највећим простором за развој.Стога се надамо и препоручујемо да се најновија истраживања изведу у ЛОЦЦ као први покушај и да се услови оптимизују.Осим тога, очекује се да се открију и користе у систему ефикасније и тачније методе.ЛОАД се истиче у прецизној контроли флуида са постојећих ЛОЦЦ уређаја и показује јединствене предности у појединачним погонима помоћу центрифугалне силе без потребе за спољним погонима, док паралелни одговори могу бити одвојени и синхронизовани.Тако ће у будућности ЛОАД постати главна микрофлуидна платформа са мање ручних операција и зрелијим и аутоматизованим технологијама.µПАД платформа комбинује предности ЛОЦЦ-а и материјала на папиру за јефтину дијагностику за једнократну употребу.Стога, будући развој треба да се фокусира на погодне и добро успостављене технологије.Поред тога, ЛФА је веома погодан за детекцију голим оком, обећавајући смањење потрошње узорка и убрзање детекције.Детаљно поређење платформе приказано је у табели 2.
Дигиталне анализе деле узорак на много микрореактора, од којих сваки садржи дискретни број циљних молекула [139, 140].Дигитални тестови нуде значајне предности за извођење апсолутне квантификације извођењем хиљада паралелних биохемијских експеримената истовремено и појединачно у одељцима микронске скале уместо у континуираној фази.У поређењу са традиционалном микрофлуидиком, компартмент реакције могу смањити запремину узорка, повећати ефикасност реакције и лако се интегрисати са другим аналитичким методама без потребе за каналима, пумпама, вентилима и компактним дизајном [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Следеће две методе се користе у дигиталним тестовима да би се постигло уједначено и тачно раздвајање раствора, укључујући реагенсе и узорке као што су ћелије, нуклеинске киселине и друге честице или молекули: (1) емулзије у облику капљица које искоришћавају нестабилност интерфејса течности;(2) подела низа се врши геометријским ограничењима уређаја.У првом методу, капљице које садрже реагенсе и узорке у микроканалима могу се створити пасивним методама као што су истовремени, унакрсни ток, фокусирање протока, степенасто емулговање, емулзификација микроканала и мембране кроз вискозне силе смицања и емулзификација са променом канала.локализацијом [143, 145, 146, 148, 149] или коришћењем активних метода [150, 151], које уносе додатну енергију путем електричне, магнетне, термичке и механичке контроле.У последњем приступу, најбоља униформност запремине течности у микрофлуидним коморама се дели задржавањем просторних структура исте величине, као што су микројаме и површински низови [152,153,154].Посебно, капљице су главни делови протока који се такође могу генерисати и манипулисати на низовима електрода заснованим на дигиталној микрофлуидици (ДМФ).Електроквашење диелектрика је једна од најбоље проучаваних теорија ДМФ-а, пошто електроквашење диелектрика омогућава прецизну манипулацију појединачних капи, контролишући облик течности и асиметричне електричне сигнале који пролазе кроз различите стране [141, 144].Главне операције са капљицама у ДМФ-у укључују сортирање, цепање и спајање [151, 155, 156], које се могу применити у различитим областима анализе, посебно у молекуларној детекцији [157, 158, 159].
Дигитална детекција нуклеинске киселине је молекуларна дијагностичка технологија треће генерације која прати конвенционални ПЦР и квантитативни ПЦР у реалном времену (кПЦР), паралелно са секвенцирањем високе пропусности и течном биопсијом.У последње две деценије дигиталне нуклеинске киселине су се брзо развиле у области молекуларне дијагностике инфективних патогена [160, 161, 162].Апсолутна квантификација дигиталне детекције нуклеинске киселине почиње паковањем узорака и реагенса у појединачне одељке како би се осигурало да свака циљна секвенца има исту вероватноћу да уђе у сваки појединачни одељак.Теоретски, сваком делу може бити додељено више циљних секвенци, или можда не постоји независни систем микрореакције.Кроз различите механизме сенсинга описане горе, одељци са микробним циљним секвенцама које генеришу сигнале изнад одређеног прага могу се визуелизовати голим оком или машином и означени су као позитивни, док су други одељци који генеришу сигнале испод прага означени као позитивни. .негативне, што сигнал за сваки одељак чини логичким.Дакле, израчунавањем броја створених одељака и стопе позитивних резултата након реакције, оригиналне копије узорака за тестирање могу се упарити коришћењем формуле Поиссонове дистрибуције без потребе за стандардном кривом, која је потребна за рутинске квантитативне анализе као што је као кПЦР.[163] У поређењу са традиционалним методама молекуларне дијагностике, дигитална детекција нуклеинских киселина има већи степен аутоматизације, већу брзину и осетљивост анализе, мање реагенса, мање контаминације и једноставнији дизајн и производњу.Из ових разлога, употреба дигиталних тестова, посебно метода заснованих на капљицама, за молекуларну дијагностику, комбинујући технике појачања и очитавања сигнала, добро је проучавана током критичног избијања САРС-ЦоВ-2.На пример, Иин ет ал.[164] комбиновао је дигиталну и брзу ПЦР методу за откривање гена ОРФ1аб, Н и РНасе П у САРС-ЦоВ-2 у микрофлуидном чипу.Значајно је да је систем био у стању да идентификује позитиван сигнал у року од 115 секунди, што је брже од конвенционалног ПЦР-а, што указује на његову ефикасност у детекцији на лицу места (слика 7а).Донг ет ал.[165], Сов ет ал.[157], Цхен ет ал.[166] и Алтери ет ал.[167] је такође применио дигитални ПЦР (ддПЦР) за откривање САРС-ЦоВ-2 у микрофлуидном систему са импресивним резултатима.Да би даље побољшали стопу детекције, Схен ет ал.[168] су постигли ддПЦР базирану слику чипа за само 15 с без употребе техника спајања слика, убрзавајући процес ддПЦР технологије од лабораторије до примене.Не примењују се само методе термичке амплификације као што је ПЦР, већ се користе и методе изотермне амплификације да би се поједноставили услови реакције и брз одговор.Лу ет ал.[71] је развио СлипЦхип за анализу капљица, способан да генерише капљице различитих величина при високим густинама у једном кораку и квантификује САРС-ЦоВ-2 нуклеинске киселине користећи дигиталну ЛАМП (Слика 7б).Као технологија која се брзо развија, ЦРИСПР такође може да игра важну улогу у дигиталној детекцији нуклеинских киселина путем згодног колориметријског снимања без потребе за додатним мрљама нуклеинске киселине.Ацкерман ет ал.развио комбинаторну матричну реакцију за мултиплексну евалуацију нуклеинских киселина.[158] открили су 169 вируса повезаних са људима, укључујући САРС-ЦоВ-2, у капљицама које садрже реагенсе за детекцију нуклеинске киселине засноване на ЦРИСПР-Цас13 у тесту микробуњица (слика 7ц).Поред тога, изотермно појачање и ЦРИСПР технологија се могу користити у истом систему да би се комбиновале предности оба.Парк и др.[169] ЦРИСПР/Цас12а дигитални тест је развијен у комерцијалном микрофлуидном чипу за детекцију екстрахованог и топлотно уништеног САРС-ЦоВ-2 на основу једностепеног РТ-РПА са краћом и већом детекцијом сигнал-позадина временски однос., шири динамички опсег и боља осетљивост (слика 7д).Неки описи ових примера дати су у табели 3.
Типична дигитална платформа за детекцију нуклеинских киселина.а Брзи дигитални ПЦР радни ток се састоји од четири кључна корака: припрема узорка, дистрибуција реакционе смеше, процес амплификације и квантификација циља (прилагођено из [164]).б Шематски приказ анализе СлипЦхип капљица за формирање капљица при великој густини (прилагођено из [71]).ц ЦАРМЕН-Цас дијаграм тока рада13 (прилагођено из [158]).д Преглед напредне дигиталне детекције вируса са ЦРИСПР/Цас у једном лонцу (прилагођено из [169]).В/О вода у уљу, полидиметилсилоксан ПДМС, ланчана реакција ПЦР полимеразе, прикупљање ДАК података, ПИД пропорционални интегрални дериват, ЦАРМЕН комбинаторна матрична реакција за мултиплексну евалуацију нуклеинске киселине, САРС-ЦоВ-2, тешки акутни респираторни синдром, коронавирус 2, РТ Амплификација реверзне транскриптазе рекомбиназе полимеразе-РПА, С/Б сигнала у позадини