Вести

Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Верзија претраживача коју користите има ограничену подршку за ЦСС.За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).У међувремену, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказаћемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Методе ензимског обележавања близине засноване на активираним естрима или фенокси радикалима се широко користе за мапирање субћелијских протеома и протеинских интерактора у живим ћелијама.Међутим, активирани естри су мање реактивни, што резултира широким радијусом обележавања, а фенокси радикали настали третманом пероксидом могу ометати редокс путеве.Овде извештавамо о методи фотоактивације зависне од обележавања близине (ПДПЛ) развијеној генетичким повезивањем миниСОГ фотосензибилизаторског протеина са протеином од интереса.Покренут плавим светлом и контролисан временом излагања, генерише се синглетни кисеоник, а затим се постиже просторно-временски разрешено обележавање хистидинских остатака помоћу анилинске сонде.Показујемо његову високу верност кроз мапирање протеома специфичног за органеле.Упоредно поређење ПДПЛ-а са ТурбоИД-ом показује специфичнију и свеобухватнију протеомску покривеност ПДПЛ-а.Затим смо применили ПДПЛ на транскрипциони коактиватор БРД4 и Е3 Паркин лигазу повезан са болешћу и пронашли раније непознате интеракторе.Скринингом прекомерне експресије, два непозната супстрата, Ссу72 и СНВ1, идентификована су за Паркин, чија је деградација посредована путем убиквитинације-протеазома.
Тачна карактеризација протеинских мрежа лежи у основи многих фундаменталних ћелијских процеса.Због тога ће високо прецизно просторно-темпорално мапирање интеракција протеина обезбедити молекуларну основу за дешифровање биолошких путева, патологије болести и нарушавање ових интеракција у терапеутске сврхе.У том циљу, методе које могу да открију временске интеракције у живим ћелијама или ткивима су веома пожељне.Масена спектрометрија пречишћавања афинитета (АП-МС) се историјски користила за идентификацију партнера за везивање протеина од интереса (ПОИ).Развојем квантитативних метода протеомике створен је Биоплек3.0, највећа база података протеинских мрежа заснована на АП-МС.Иако је АП-МС веома моћан, кораци ћелијске лизе и разблаживања у току рада су пристрасни према слабим и пролазним интеракцијама везивања и уводе артефакте након лизе као што су лажни парови интеракције којима недостаје раздвајање пре лизе.
Да би се решили ова питања, развијене су неприродне аминокиселине (УАА) са групама за умрежавање и платформе за ензимско обележавање у близини (ПЛ) (нпр. АПЕКС и БиоИД)5.Иако је УАА метода успешно примењена у многим сценаријима и пружа информације о директним протеинским лепковима, оптимизација места уметања УАА је и даље потребна.Што је још важније, то је стехиометријска метода обележавања којој недостаје каталитички преокрет догађаја обележавања.Насупрот томе, ензимске ПЛ методе, као што је БиоИД метода, спајају конструисану биотинску лигазу са ПОИ7, који затим активира биотин да би се формирао реактивни биотинил-АМП естарски интермедијер.Ензим на тај начин катализује и ослобађа активирани биотински „облак” који обележава проксималне остатке лизина.Међутим, БиоИД-у је потребно више од 12 сати да би се добио довољан означени сигнал, што спречава његову употребу са временском резолуцијом.Користећи усмерену еволуцију засновану на приказу квасца, ТурбоИД је дизајниран на основу БиоИД-а да буде ефикаснији, омогућавајући ефикасно обележавање биотином у року од 10 минута, омогућавајући проучавање динамичнијих процеса.Пошто је ТурбоИД веома активан и нивои ендогеног биотина су довољни за обележавање ниског нивоа, позадинско обележавање постаје потенцијални проблем када је потребно високо појачано и временско обележавање додавањем егзогеног биотина.Поред тога, активирани естри су слабо реактивни (т1/2 ~5 мин), што може довести до великог радијуса обележавања, посебно након засићења суседних протеина биотином 5. У другом приступу, генетска фузија пројектоване аскорбат пероксидазе (тј. биотин- фенол радикале и омогућава обележавање протеина у року од једног минута9, 10. АПЕКС се широко користи за идентификацију субцелуларних протеома, комплекса мембранских протеина и цитосолних сигналних протеинских комплекса.11,12 Међутим, потреба за високим концентрацијама пероксида може утицати на редокс протеине или путеве, ометајући ћелијски процеси.
Дакле, нова метода која може да генерише реактивније врсте супресије обележеног радијуса са високом просторном и временском тачношћу без значајног ометања ћелијских путева биће важан додатак постојећим методама. Међу реактивним врстама, синглетни кисеоник је изазвао нашу пажњу због свог кратког животног века и ограниченог радијуса дифузије (т1/2 < 0,6 µс у ћелијама)13. Међу реактивним врстама, синглетни кисеоник је изазвао нашу пажњу због свог кратког животног века и ограниченог радијуса дифузије (т1/2 < 0,6 µс у ћелијама)13. Среди активних форм наше внимание привлек синглетниј кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченог радиуса дифузије (т1/2 < 0,6 мкс в клетки)13. Међу активним облицима, синглетни кисеоник је привукао нашу пажњу због свог кратког животног века и ограниченог радијуса дифузије (т1/2 < 0,6 µс у ћелијама)13.在活性物质中,单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中т1/2 < 0,6 µс）1 µс（с 1/2 < 0,6 µс）而引起了我们的注意13 Среди активних форм наше внимание привлекает синглетниј кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченог радиуса дифузије (т1/2 < 0,6 мкс в клетки). Међу активним облицима, синглетни кисеоник привлачи нашу пажњу због свог кратког животног века и ограниченог радијуса дифузије (т1/2 < 0,6 μс у ћелијама).Пријављено је да појединачни кисеоник насумично оксидира метионин, тирозин, хистидин и триптофан, чинећи га поларним 14,15 за везивање за сонде на бази амина или тиола16,17.Иако је синглетни кисеоник коришћен за обележавање РНК субћелијског одељка, стратегије за пренамену ендогених маркера близине ПОИ остају неистражене.Овде представљамо платформу названу фотоактивационо-зависно обележавање близине (ПДПЛ), где користимо плаво светло да осветлимо ПОИ спојене са миниСОГ фотосензибилизатором и покренемо генерисање синглетног кисеоника за оксидацију проксималних остатака, праћених модификацијама које садрже амин да оксидују хемијске сонде у средње живе ћелије..Тестирали смо групу хемијских сонди да бисмо максимизирали специфичност ознаке и идентификовали места модификације користећи отворени ток рада протеомике.Упоредно поређење ПДПЛ-а са ТурбоИД-ом показује специфичнију и свеобухватнију протеомску покривеност ПДПЛ-а.Овај приступ смо применили на маркере субцелуларног протеома специфичне за органеле и општу идентификацију протеома везујућих партнера за епигенетски регулаторни протеин БРД4 повезан са раком и Е3 лигазу Паркин повезан са Паркинсоновом болешћу, што је потврдило и познату и непознату мрежу протеина. интеракције..Способност ПДПЛ-а да препозна Е3 супстрате у великим протеинским комплексима представља ситуацију у којој је потребно препознавање индиректних везива.Два непозната супстрата паркина посредована убиквитинационим протеазомом су потврђена ин ситу.
Фотодинамичка терапија (ПДТ)19 и ласерска инактивација уз помоћ хромофора (ЦАЛИ)20, у којој светлосно зрачење фотосензибилизаторима ствара синглетни кисеоник, може да инактивира циљне протеине или да изазове смрт ћелије.Пошто је синглетни кисеоник високо реактивна супстанца са теоретском дифузионом удаљености од око 70 нм, просторно ограничена оксидација око фотосензибилизатора може се контролисати.На основу овог концепта, одлучили смо да користимо синглетни кисеоник за постизање блиског обележавања протеинских комплекса у живим ћелијама.Развили смо ПДПЛ хемопротеомски приступ да испунимо четири функције: (1) да катализирамо стварање активног синглетног кисеоника слично ПЛ ензимском приступу;(2) обезбедити временски решено обележавање након иницирања светлости;(3) изменама (4) Избегавајте коришћење ендогених кофактора (као што је биотин) да бисте смањили позадину, или користите егзогене реагенсе који веома узнемиравају (као што су пероксиди) да бисте минимизирали изложеност ћелија стресу околине.
Фотосензибилизатори се могу поделити у две категорије укључујући флуорофоре мале молекуларне тежине (нпр. бенгалска ружа, метилен плаво)22 и генетски кодиране мале протеине (нпр. миниСОГ, КиллерРед)23.Да бисмо постигли модуларни дизајн, развили смо прву генерацију ПДПЛ платформе додавањем протеина фотосензибилизатора (ПС) у ПОИ24,25 (Слика 1а).Када је озрачен плавом светлошћу, синглетни кисеоник оксидира проксималне нуклеофилне аминокиселинске остатке, што доводи до умполунг поларитета који је електрофилан и може даље да реагује са нуклеофилима аминске сонде16,17.Сонда је дизајнирана са алкинском ручком која омогућава хемију клика и повлачење надоле за ЛЦ/МС/МС карактеризацију.
Шематски приказ обележавања протеинских комплекса посредованих миниСОГ.Када су изложене плавој светлости, ћелије које експримирају миниСОГ-ПОИ стварају синглетни кисеоник, који модификује протеине у интеракцији, али не и невезујуће протеине.Интермедијарни производи фотооксидације пресрећу се релејним ознакама хемијске сонде амина да би се формирали ковалентни адукти.Алкинил група на хемијској сонди омогућава хемију клика за обогаћивање повлачењем надоле праћено ЛЦ-МС/МС квантитацијом.б Хемијска структура аминских сонди 1-4.ц Репрезентативна флуоресцентна гел анализа митохондријалних локализованих миниСОГ-посредованих протеомских маркера коришћењем сонди 1-4 и релативне квантификације засноване на дензитометрији на гелу.Однос сигнала и позадине хемијских сонди је процењен коришћењем експеримената негативне контроле искључујући плаво светло или коришћењем ХЕК293Т ћелија без експресије миниСОГ.н = 2 биолошки независна узорка.Свака тачка представља биолошку реплику.д Репрезентативно откривање и квантификација ПДПЛ коришћењем оптимизоване сонде 3 у присуству или одсуству назначених ПДПЛ компоненти као што је ц.н = 3 биолошки независна узорка.Свака тачка представља биолошку реплику.Средишње линије и бркови представљају средњу вредност и ± стандардну девијацију.ЦББ: Цоомассие Бриллиант Блуе.е Конфокално снимање синглетног кисеоника са далеко црвеном Си-ДМА мрљом.Скала бар: 10 µм.Гел и конфокални експерименти су независно поновљени најмање два пута са сличним резултатима.
Прво смо тестирали способност зрелих фотосензибилизатора миниСОГ26 и КиллерРед23, стабилно изражених у ХЕК293Т, да посредују у пропаргиламинском обележавању протеома као хемијске сонде (додатна слика 1а).Анализа флуоресценције гела је показала да је обележавање целокупног протеома постигнуто коришћењем миниСОГ-а и зрачења плавим светлом, док није примећен видљив производ за обележавање са КиллерРед-ом.Да бисмо побољшали однос сигнала и позадине, затим смо тестирали сет хемијских сонди које садрже анилин (1 и 3), пропиламин (2) или бензиламин (4).Приметили смо да саме ћелије ХЕК293Т имају већи позадински сигнал у поређењу са одсуством плаве светлости, вероватно због ендогеног рибофлавин фотосензибилизатора, флавин мононуклеотида (ФМН) 27 . Хемијске сонде 1 и 3 засноване на анилину дале су бољу специфичност, при чему ХЕК293Т стабилно изражава миниСОГ у митохондријама показујући >8 пута повећање сигнала за сонду 3, док је сонда 2 коришћена у методи обележавања РНК ЦАП-сек приказује само ~2,5- фолд повећање сигнала, вероватно због различитих преференција реактивности између РНК и протеина (слика 1б, ц). Хемијске сонде 1 и 3 засноване на анилину дале су бољу специфичност, при чему ХЕК293Т стабилно изражава миниСОГ у митохондријама показујући >8 пута повећање сигнала за сонду 3, док је сонда 2 коришћена у методи обележавања РНК ЦАП-сек приказује само ~2,5- фолд повећање сигнала, вероватно због различитих преференција реактивности између РНК и протеина (слика 1б, ц).Хемијске сонде 1 и 3 на бази анилина показале су бољу специфичност: ХЕК293Т, који стабилно изражава миниСОГ у митохондријама, показује више од 8 пута повећање сигнала за сонду 3, док сонда 2, која се користи у методи обележавања ЦАП-сек РНК, само показује ~2,5 пута повећање сигнала, вероватно због различитих преференција реактивности између РНК и протеина (слика 1б, ц).基于 苯胺 化学 探针 探针 和 3 具有 具有 好 的 的, хек293т 在 线 粒体 中 稳定 线 线 粒体 中 表达 线 探针 探针 3 的 信号 增加> 8 倍, 而 用 于 рна 标记 方法 цап-сек 的 探针 2 仅 显示 显示 显示2.5-倍信号增加,可能是由于РНА 和蛋白质之间的不同反应偏好(图1б,ц)。基于 苯胺 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性, ХЕК293Т 在 粒体 中 稳定 表达 МиниСог, 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 而 于 于 РНА 标记 Цап-ек 的 2 仅 ~ ~ ~ 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加,可能是由于РНАХемијске сонде 1 и 3 засноване на анилину имале су бољу специфичност, ХЕК293Т је стабилно експримирао миниСОГ у митохондријама, а сонда 3 је имала преко 8 пута повећање сигнала, док је сонда 2 за метод обележавања ЦАП-сек РНК показала само ~2,5 пута повећање.у сигналу, вероватно због различитих преференција реакције између РНК и протеина (слика 1б, ц).Поред тога, тестирани су изомери сонде 3 и сонде хидразина (сонде 5, 6, 7), што је потврдило оптимизацију сонде 3 (додатна слика 1б, ц).Слично, анализа флуоресценције у гелу открила је друге оптимизоване експерименталне параметре: таласну дужину зрачења (460 нм), концентрацију хемијске сонде (1 мМ) и време зрачења (20 мин) (додатна слика 2а-ц).Изостављање било које компоненте или корака у ПДПЛ протоколу довело је до значајног преокрета сигнала у позадини (слика 1д).Значајно је да је обележавање протеина значајно смањено у присуству натријум азида или тролокса, за које је познато да гасе синглетни кисеоник.Присуство Д2О, за које је познато да стабилизује синглетни кисеоник, побољшава сигнал обележавања.Да би се истражио допринос других реактивних врста кисеоника обележавању, додати су манитол и витамин Ц да би се успоставили хватачи хидроксилних и супероксидних радикала, 18, 29, али није утврђено да смањују обележавање.Додавање Х2О2, али не и осветљење, није довело до обележавања (додатна слика 3а).Флуоресцентно снимање синглетног кисеоника са Си-ДМА сондама потврдило је присуство синглетног кисеоника у ХЕК293Т-миниСОГ жици, али не и у оригиналној ХЕК293Т жици.Поред тога, митоСОКС Ред није могао да открије производњу супероксида након осветљења (слика 1е и додатна слика 3б) 30. Ови подаци снажно сугеришу да је синглетни кисеоник главна реактивна врста кисеоника одговорна за накнадно протеомско обележавање.Цитотоксичност ПДПЛ-а је процењена укључујући зрачење плавим светлом и хемијске сонде, а није примећена значајна цитотоксичност (додатна слика 4а).
Да бисмо проучили механизам обележавања и омогућили протеомску идентификацију протеинских комплекса коришћењем ЛЦ-МС/МС, прво треба да одредимо које аминокиселине су модификоване и делта масу ознака сонде.Пријављено је да су метионин, хистидин, триптофан и тирозин модификовани синглет кисеоником14,15.Интегришемо ТОП-АБПП31 радни ток са непристрасном отвореном претрагом коју обезбеђује ФрагПипе рачунарска платформа заснована на МСФраггер32.Након модификације синглетног кисеоника и обележавања хемијском сондом, изведена је хемија клика коришћењем етикете за редукцију биотина која садржи линкер који се може цепати, након чега је уследило истезање неутравидина и варење трипсина.Модификовани пептид, који је још увек везан за смолу, је фотоцепљен за ЛЦ-МС/МС анализу (слика 2а и додатни подаци 1).Велики број модификација се десио у целом протеому са преко 50 наведених подударања пептидних мапа (ПСМ) (слика 2б).Изненађујуће, приметили смо само модификацију хистидина, вероватно због веће реактивности оксидисаног хистидина према анилинским сондама од других аминокиселина.Према објављеном механизму оксидације хистидина синглет кисеоником,21,33 предложена делта-масена структура од +229 Да одговара адукту сонде 3 са 2-оксо-хистидином после две оксидације, док је +247 Да производ хидролизе. од +229 Да (допунска слика 5).Процена МС2 спектра показала је високу поузданост идентификације већине и и б јона, укључујући идентификацију модификованих јона фрагмената (и и б) (слика 2ц).Анализа контекста локалне секвенце ПДПЛ-модификованих хистидина открила је умерену преференцију мотива за мале хидрофобне остатке на ±1 позицији (додатна слика 4б).У просеку је идентификовано 1,4 хистидина по протеину, а места ових маркера су одређена анализом површине доступне растварачу (САСА) и релативне доступности растварача (РСА) (додатна слика 4ц,д).
Непристрасан радни ток за проучавање преостале селективности користећи ФрагПипе рачунарску платформу коју покреће МСФраггер.Цепабилни линкери се користе у Цлицк хемији да би се омогућило фотоцепање модификованих пептида из стрептавидин смоле.Покренута је отворена претрага како би се идентификовале бројне модификације, као и релевантни остаци.б Доделити масу модификација које се јављају у целом протеому.Мапирање пептида ПСМ.ц МС2 спектрална анотација хистидинских места модификованих сондом 3. Као репрезентативан пример, ковалентна реакција са сондом 3 је додала +229,0938 Да модификованој амино киселини.д Тест мутације који се користи за тестирање ПДПЛ маркера.ПРДКС3 (Х155А, Х225А) и ПРДКС1 (Х10А, Х81А, Х169А) су трансфектовани плазмидима дивљег типа за анти-Флаг детекцију.е Синтетички пептид је реаговао са пречишћеним миниСОГ у присуству сонде 3 и одговарајући производи са Δм +247 и +229 су забележени у ЛЦ-МС спектру.ф Интеракције протеин-протеин ин витро моделоване са миниСОГ-6кХис-тагом и анти-6кХис антителом.Антибиотин (стрептавидин-ХРП) и анти-мишја Вестерн блот анализа комплекса антитела миниСОГ-6кХис/анти-6кХис обележених сондом 3, у зависности од времена излагања светлости.Ознаке за појединачне протеине су изражене у одговарајућој молекулској тежини: лаки ланац ЛЦ антитела, тешки ланац ХЦ антитела.Ови експерименти су независно поновљени најмање два пута са сличним резултатима.
За биохемијску верификацију места обележавања, ПРДКС3 и ПРДКС1 идентификовани масеном спектрометријом су промењени са хистидина у аланин и упоређени са дивљим типом у тестовима трансфекције.ПДПЛ резултати су показали да је мутација значајно смањила обележавање (слика 2д).У међувремену, пептидне секвенце идентификоване у отвореној претрази су синтетизоване и реаговале ин витро са пречишћеним миниСОГ у присуству сонде 3 и плаве светлости, дајући производе са помаком масе од +247 и +229 Да када се детектују помоћу ЛЦ-МС (Слика 2е).).Да бисмо тестирали да ли се проксимални протеини у интеракцији могу означити ин витро као одговор на фотоактивацију миниСОГ, дизајнирали смо вештачки тест близине интеракцијом између миниСОГ-6кХис протеина и анти-Хис моноклонског антитела ин витро (слика 2ф).У овом тесту смо очекивали проксимално обележавање тешких и лаких ланаца антитела са миниСОГ.У ствари, анти-миш (препознавање тешких и лаких ланаца анти-6кХис-обележених антитела) и стрептавидин Вестерн блотс показали су снажну биотинилацију тешких и лаких ланаца.Посебно смо приметили миниСОГ аутобиотинилацију због ознаке 6кХис и унакрсних веза између лаких и тешких ланаца, што може бити повезано са претходно описаним јазом између лизина и проксималног одговора 2-оксо-хистидина.У закључку, закључујемо да ПДПЛ модификује хистидин на начин који зависи од близине.
Наш следећи циљ је био да окарактеришемо субћелијски протеом да бисмо тестирали специфичност ин ситу обележавања.Због тога смо стабилно експримирали миниСОГ у језгру, митохондријском матриксу или спољашњој ЕР мембрани ћелија ХЕК293Т (слика 3а).Анализа флуоресценције гела открила је обиље обележених трака на три субћелијске локације, као и различите обрасце обележавања (слика 3б).Анализа флуоресценције је показала високу специфичност ПДПЛ (слика 3ц).ПДПЛ радни ток је праћен реакцијама клика са родаминским бојама да би се оцртали субцелуларни протеоми помоћу флуоресцентне микроскопије, а ПДПЛ сигнали су колокализовани са ДАПИ, митохондријалним трагачима или ЕР трацкерима, потврђујући високу верност ПДПЛ-а.За три локације органела, упоредо поређење ПДПЛ-а са ТурбоИД-ом коришћењем авидин вестерн блот-а показало је да је ПДПЛ означен конкретније у поређењу са њиховим одговарајућим контролама.У условима ПДПЛ, појавило се више обележених трака, што указује на више протеина обележених ПДПЛ (додатна слика 6а-д).
а Шематски приказ обележавања протеома специфичних за органеле посредоване миниСОГ.миниСОГ циља митохондријску матрицу фузијом са Н-терминалним 23 аминокиселина људског ЦОКС4 (мито-миниСОГ), језгро фузијом са Х2Б (нуклеус-миниСОГ) и Сец61β преко цитоплазматске стране ЕР мембране (ЕР-миниСОГ) ).Индикације укључују снимање у гелу, конфокално снимање и масену спектрометрију.б Репрезентативне гел слике три ПДПЛ профила специфична за органеле.ЦББ Цоомассие Бриллиант Блуе.ц Репрезентативне конфокалне слике ћелија ХЕК293Т које стабилно експримирају миниСОГ са различитим субћелијским локализацијама откривеним антителом означеним В5 (црвено).Субцелуларни маркери се користе за митохондрије и ЕР (зелени).ПДПЛ радни ток укључује детекцију миниСОГ (жуто) обележених субћелијских протеома коришћењем Ци3-азидне клик хемије.Скала бар: 10 µм.д Вулкански дијаграми ПДПЛ-означених протеома у различитим органелама квантификовани необележеном квантификацијом (н = 3 независна биолошка експеримента).Двострани Студентов т-тест је коришћен на парцелама вулкана.ХЕК293Т дивљи тип је коришћен као негативна контрола. Значајно измењени протеини су означени црвеном бојом (п < 0,05 и >2-струка разлика у интензитету јона). Значајно измењени протеини су означени црвеном бојом (п < 0,05 и >2-струка разлика у интензитету јона). Значительно изменене беле виделени красним цветом (п < 0,05 и >2-кратнаа разница в интензивности ионов). Значајно измењени протеини су истакнути црвеном бојом (п < 0,05 и >2-струка разлика у интензитету јона).显着变化的蛋白质以红色突出显示 (п < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。).显着变化的蛋白质以红色突出显示（п < 0,05和> 2 Значительно изменене беле виделени красним цветом (п < 0,05 и > 2-кратнаа разница в ионној силе). Значајно измењени протеини су означени црвеном бојом (п < 0,05 и > 2-струка разлика у јонској снази).Сродни протеини важни за ХЕК293Т-миниСОГ, али нису важни за ХЕК293Т, приказани су зеленом бојом.е Анализа специфичности протеомских скупова података из експеримената д.Укупан број статистички значајних протеина у свакој органели (црвене и зелене тачке) је означен на врху.Хистограми показују протеине локализоване у органеле на основу МитоЦарта 3.0, ГО анализе и А. Тинг ет ал.људи.Одвојени скупови података за митохондрије, језгра и ЕР.Ови експерименти су независно поновљени најмање два пута са сличним резултатима.Необрађени подаци се пружају у облику датотека необрађених података.
Подстакнута резултатима гела и сликања, квантификација без ознака је коришћена за квантификацију идентификованог протеома у свакој органели (додатни подаци 2).Нетрансфектовани ХЕК293Т је коришћен као негативна контрола за одузимање позадинских маркера. Анализа графикона вулкана показала је значајно обогаћене протеине (п < 0,05 и >2-струки интензитет јона) као и синглетон протеине који су присутни само у линијама које експримирају миниСОГ (слика 3д црвене и зелене тачке). Анализа графикона вулкана показала је значајно обогаћене протеине (п < 0,05 и >2-струки интензитет јона) као и синглетон протеине који су присутни само у линијама које експримирају миниСОГ (слика 3д црвене и зелене тачке). Анализ графике вулкана показао значајно обогасенние белки (п <0, 05 и > 2-кратнаа интензивность ионов), а также одиночние белки, которие присутствуут только в линиах, експрессуусих миниСОГ (рис. 3д, красние и зелене точки). Анализа графикона вулкана показала је значајно обогаћене протеине (п<0,05 и >2-струки интензитет јона) као и појединачне протеине који су присутни само у линијама које експримирају миниСОГ (слика 3д, црвене и зелене тачке).火山图 分析 出 显着 显着 富集 富集 (п <0,05 和> 2 倍 离子 强度) 以及 仅 存 在于 минисог 表达 表达 系 中 的 的 单一 (图 3д 红色 和 绿色点).火山图 分析 出 显着 的 的 (п <0,05 和> 2 倍 离子 强度) 仅 存 在于 在于 минисог 表达 系 系 系 单一 单一 (图 3д 红色 绿色点 ...)))))))))))))))) Анализирана графика вулкана показала значајно обогасенние белки (п <0, 05 и> 2к ионнаа сила), а также отдельние белки, присутствуусие только в експресионној линии миниСОГ (красние и зелене точки на рис. 3д). Анализа вулканског графикона открила је значајно обогаћене протеине (п<0,05 и >2к јонске снаге) као и појединачне протеине присутне само у експресионој линији миниСОГ (црвене и зелене тачке на слици 3д).Комбинујући ове податке, идентификовали смо 1364, 461 и 911 статистички значајних нуклеарних, митохондријалних и ЕР спољних мембранских протеина, респективно.Да бисмо анализирали тачност ПДПЛ-а локализованог у органелу, користили смо МитоЦарта 3.0, анализу генске онтологије (ГО) и А. Тинг ет ал.скуп података8 је коришћен за митохондрије, језгро и ЕР за тестирање специфичности органела откривених протеина, што одговара тачности од 73,4, 78,5 и 73,0% (слика 3е).Специфичност ПДПЛ потврђује да је ПДПЛ идеално средство за идентификацију протеома специфичних за органеле.Значајно, субмитохондријална анализа идентификованих митохондријалних протеина показала је да је заробљени протеом углавном распоређен у матриксу и унутрашњој мембрани (226 и 106, респективно), што чини 91,7% (362) од укупног броја идентификованих митохондријалних протеина.додатно је потврђен висок ниво ПДПЛ-а (допунска слика 7а).Слично томе, субнуклеарна анализа је показала да је ухваћени протеом углавном распоређен у језгру, нуклеоплазми и нуклеолусу (додатна слика 7б).Нуклеарна протеомска анализа са сигналним пептидом нуклеарне локализације (3кНЛС) показала је сличну тачност као Х2Б конструкт (додатна слика 7ц-х).Да би се одредила специфичност ПДПЛ маркера, нуклеарни ламинин А је изабран као дискретније локализована замка ПОИ7.ПДПЛ је идентификовао 36 значајно обогаћених протеина, од којих су 12 протеина (30,0% укључујући ламин А) били добро окарактерисани протеини који интерагују са ламином А означени у бази података Стринг, са већим процентом од БиоИД методе (122 протеина) 28 од 28. , 22.9 %) 7. Наш метод је идентификовао мање протеина, вероватно због ограничених области обележавања, што је омогућено активнијим синглетним кисеоником.ГО анализа је показала да су идентификовани протеини углавном лоцирани у нуклеоплазми (26), нуклеарној мембрани (10), нуклеарној мембрани (9) и нуклеарним порама (5).Заједно, ови нуклеарно-локализовани протеини су чинили 80% обогаћених протеина, што даље показује специфичност ПДПЛ (додатна слика 8а-д).
Након што смо утврдили способност ПДПЛ-а да изврши обележавање близине у органелама, затим смо тестирали да ли се ПДПЛ може користити за анализу партнера који се везују за ПОИ.Конкретно, настојали смо да дефинишемо ПДПЛ анализу цитосолних протеина, који се сматрају тежим циљевима од њихових колега локализованих на мембрани због њихове веома динамичне природе.Бромодомен и екстратерминални (БЕТ) протеин БРД4 привукао је нашу пажњу због своје кључне улоге у различитим болестима 35, 36 .Комплекс формиран од БРД4 је коактиватор транскрипције и важан терапеутски циљ.Регулисањем експресије ц-миц и Внт5а фактора транскрипције, сматра се да је БРД4 кључна детерминанта акутне мијелоичне леукемије (АМЛ), мултиплог мијелома, Буркитовог лимфома, рака дебелог црева и инфламаторних болести37,38.Поред тога, неки вируси циљају БРД4 да регулишу вирусну и ћелијску транскрипцију, као што су папилома вирус, ХИВ и САРС-ЦоВ-236,39.
Да бисмо мапирали БРД4 интеракцију користећи ПДПЛ, комбиновали смо миниСОГ са кратком Н- или Ц-терминалном изоформом БРД4.Протеомски резултати су открили висок степен преклапања између два конструкта (додатна слика 9а).Нуклеарни протеом идентификован са миниСОГ-Х2Б покрива 77,6% протеина који су у интеракцији са БРД4 (допунска слика 9б).Затим су различита времена осветљења (2, 5, 10, 20 мин) коришћена за подешавање полупречника маркера (слика 4а и додатни подаци 3).Закључујемо да ће у краћим фотопериодима, ПДПЛ првенствено означавати директно везујуће партнере, док ће дужи периоди укључивати протеине идентификоване током краћих периода фотоактивације, као и индиректне мете у комплексима обележавања.У ствари, открили смо снажно преклапање између суседних временских тачака (84,6% за 2 и 5 мин; 87,7% за 5 и 10 мин; 98,7% за 10 и 20 мин) (слика 4б и додатна слика 9ц).У свим експерименталним групама, пронашли смо не само БРД4 самоозначавање, већ и неколико познатих циљева као што су МЕД1, ЦХД8, БИЦРА, НИПБЛ, СМЦ1А и ХМГБ1 означене у бази података низова.Јонска снага ових мета је пропорционална времену експозиције (слика 4ц и додатна слика 9д).ГО анализа протеина идентификованих у 2-минутној групи показала је да су идентификовани протеини локализовани у језгру и да су укључени у ремоделирање хроматина и функцију РНК полимеразе.Молекуларна функција протеина је обогаћена везивањем хроматина или транскрипционом коактивацијом, у складу са функцијом БРД4 (слика 4д).Анализа интеракције протеина у бази података са стринговима открила је први ниво индиректних интеракција између БРД4 и ХДАЦ фамилије интерагујућих комплекса као што су СИН3А, НЦОР2, БЦОР и САП130 (Слика 4е и Додатна слика 9е), у складу са БРД4 и ХДАЦ везујућим ацетилираним хистонима ..Поред тога, репрезентативни циљеви идентификовани помоћу ЛЦ-МС/МС, укључујући Син3А, НСУН2, Фус и СФПК, потврђени су Вестерн блотингом (слика 4ф).Недавно је објављено да кратка изоформа БРД4 формира језгра са својствима раздвајања течне и течне фазе (ЛЛПС).РНК везујући протеини Фус и СФПК посредују у ЛЛПС-у различитих ћелијских процеса и овде су идентификовани као незабележени БРД4 везујући протеини.Интеракција између БРД4 и СФПК потврђена је експериментима ко-имунопреципитације (цо-ИП) (слика 4г), што сугерише још један механизам за раздвајање фаза течност-течност посредовано БРД4 који заслужује даље истраживање.Узети заједно, ови резултати сугеришу да је ПДПЛ идеална платформа за идентификацију познатих БРД4 интеракција, као и непознатих везујућих протеина.
а Шематски приказ обележавања БРД4 близине посредоване миниСОГ, времена експозиције: 2, 5, 10 и 20 мин.б Преклапање протеина идентификованих у различитим временима осветљења.Обогаћивање протеином идентификовано у ХЕК293Т-миниСОГ-БРД4 било је статистички значајно у поређењу са дивљим типом ХЕК293Т.ц Интензитет јона када се квантификују необележени репрезентативни познати БРД4-везујући протеини током одређеног времена излагања.н = 3 биолошки независна узорка.Подаци су представљени као средња вредност ± стандардна девијација.д Генска онтолошка анализа (ГО) протеина идентификованих у 2-минутној групи.Наведено је првих десет ГО термина.Мехурићи су обојени према категорији ГО термина, а величина мехурића је пропорционална броју протеина који се налазе у сваком термину.е Анализа низова протеина у интеракцији са БРД4.Жути кругови су директни лепак, а сиви кругови су први слој индиректног лепка.Црвене линије представљају експериментално одређене интеракције, а плаве линије представљају предвиђене интеракције.ф Репрезентативни циљеви везивања БРД4 идентификовани у ЛЦ-МС/МС верификовани су Вестерн блоттингом.г Експерименти ко-имунопреципитације потврђују интеракцију између СФПК и БРД4.Ови експерименти су независно поновљени најмање два пута са сличним резултатима.Необрађени подаци се пружају у облику датотека необрађених података.
Поред идентификације нерегистрованих циљева повезаних са ПОИ, претпостављамо да ће ПДПЛ бити погодан за идентификацију супстрата за ензиме, што би захтевало карактеризацију индиректних везујућих протеина у великим комплексима за означавање нерегистрованих супстрата.Паркин (кодиран са ПАРК2) је Е3 лигаза и познато је да мутације у паркину изазивају аутозомно рецесивну јувенилну Паркинсонову болест (АР-ЈП)42.Поред тога, паркин је описан као неопходан за митофагију (митохондријалну аутофагију) и уклањање реактивних врста кисеоника.Међутим, иако је идентификовано неколико супстрата паркина, улога паркина у овој болести остаје нејасна.Да би се означили његови некарактеристични супстрати, ПДПЛ је тестиран додавањем миниСОГ на Н- или Ц-терминус паркина.Ћелије су третиране транспортером протона карбонил цијанида м-хлорофенилхидразоном (ЦЦЦП) да би се активирао паркин преко ПИНК1-Паркин пута.У поређењу са нашим БРД4 ПДПЛ резултатима, фузија Н-терминуса паркина открила је већи скуп циљних протеина, иако је покривала већи део Ц-терминуса (177 од 210) (слика 5а, б и додатни подаци 4).резултат је у складу са извештајима да Н-терминалне ознаке могу ненормално да активирају Паркин44.Изненађујуће, било је само 18 преклапајућих протеина у нашим подацима са објављеним АП-МС резултатима за Паркин43, вероватно због разлика између ћелијских линија и токова рада протеомике.Поред четири позната протеина (АРДМ1, ХСПА8, ПСМД14 и ПСМЦ3) идентификована помоћу две методе (слика 5ц)43.Да би се даље потврдили резултати ЛЦ-МС/МС, ПДПЛ третман и накнадни Вестерн блот коришћени су за упоређивање резултата ХЕК293Т теста родитељске ћелије и стабилне Н-терминалне линије паркина.Претходно непознате мете ЦДК2, ДУТ, ЦТБП1 и ПСМЦ4 су тестиране са познатим везивом, ДНАЈБ1 (слика 5д).
Вулкански дијаграм протеина у интеракцији с паркином у ћелијама ХЕК293Т са стабилно експримираним миниСОГ спојеним на Н- или Ц-терминус паркина (н = 3 независна биолошка експеримента).Двострани Студентов т-тест је коришћен на парцелама вулкана.ХЕК293Т је коришћен као негативна контрола. Значајно измењени протеини су означени црвеном бојом (п < 0,05 и >2-струка разлика у интензитету јона). Значајно измењени протеини су означени црвеном бојом (п < 0,05 и >2-струка разлика у интензитету јона). Значительно изменене беле виделени красним цветом (п < 0,05 и >2-кратнаа разница в интензивности ионов). Значајно измењени протеини су истакнути црвеном бојом (п < 0,05 и >2-струка разлика у интензитету јона).显着变化的蛋白质以红色突出显示 (п < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。).显着变化的蛋白质以红色突出显示（п < 0,05和> 2 Значительно изменене беле виделени красним цветом (п < 0,05 и > 2-кратнаа разница в ионној силе). Значајно измењени протеини су означени црвеном бојом (п < 0,05 и > 2-струка разлика у јонској снази).Сродни протеини важни за ХЕК293Т-миниСОГ, али нису важни за ХЕК293Т, приказани су зеленом бојом.б Венов дијаграм који приказује преклапајуће протеине између Н-терминалних и Ц-терминалних конструкција.Н-терминалне ознаке могу аберантно да активирају паркин и резултирају препознатљивијим протеинима.ц Венов дијаграм који приказује преклапајуће протеине између ПДПЛ и АП-МС.Наведени су познати интерактори, укључујући 4 од 18 преклапајућих протеина и 11 од 159 протеина специфично идентификованих у ПДПЛ.д Репрезентативни циљеви идентификовани помоћу ЛЦ-МС/МС верификовани су Вестерн блотингом.е Ссу72 и СНВ1 идентификовани су као нерегистровани паркин супстрати.Ови ФЛАГ-означени протеински плазмиди су трансфектовани у ХЕК293Т и ХЕК293Т-Паркин-миниСОГ након чега је уследио третман са ЦЦЦП у различитим временским тачкама.Деградација је била израженија у линији прекомерне експресије Паркина.ф Коришћењем инхибитора протеазома МГ132, потврђено је да је процес деградације Ссу72 и СНВ1 посредован протеазом-убиквитинацијом.Ови експерименти су независно поновљени најмање два пута са сличним резултатима.Необрађени подаци се пружају у облику датотека необрађених података.
Посебно, протеини идентификовани ПДПЛ-ом морају укључивати протеине који се везују за паркин и њихове супстрате.Да бисмо открили нерегистроване паркин супстрате, одабрали смо седам идентификованих протеина (ПУФ60, ПСПЦ1, УЦХЛ3, ППП1Р8, ЦАЦИБП, Ссу72 и СНВ1) и трансфектоване плазмиде да бисмо изложили ове гене нормалном ХЕК293Т и стабилно експримирали миниСОГ-Паркин третман након ХЕК29.Нивои Ссу72 и СНВ1 протеина су значајно смањени у стабилној миниСОГ-Паркин линији (слика 5е).Третман са ЦЦЦП током 12 сати је резултирао најзначајнијом деградацијом оба супстрата.Да би се истражило да ли је деградација Ссу72 и СНВ1 регулисана убиквитинацијом протеазома, додат је инхибитор протеасома МГ132 да инхибира активност протеасома, и у ствари смо открили да је њихов процес деградације инхибиран (слика 5ф).Додатни циљеви који нису супстрати су потврђени као Паркин интерактори коришћењем Вестерн блоттинг-а (додатна слика 10), што је показало конзистентне резултате са ЛЦ-МС/МС.У закључку, интеграција ПДПЛ радног тока са верификацијом трансфекције циљног протеина омогућава идентификацију нерегистрованих супстрата Е3 лигазе.
Развили смо заједничку платформу за обележавање близине која вам омогућава да идентификујете тачке интереса у интеракцији у простору и времену.Платформа је заснована на миниСОГ фотосензибилизатор протеину, који је само око 12 кДа, мање од половине величине зрелог ензима АПЕКС2 (27 кДа) и једне трећине величине ТурбоИД (35 кДа).Мања величина би требало да значајно прошири опсег апликација за проучавање малих протеинских интерактома.Потребно је даље истраживање додатних фотосензибилизатора, било да су генетски кодирани протеини или мали молекули, да би се повећао квантни принос синглетног кисеоника и проширила осетљивост овог приступа.За тренутну верзију миниСОГ-а, висока временска резолуција се може постићи коришћењем плавог осветљења за активирање маркера близине.Поред тога, дуже време излагања ослободило је већи „облак“ синглетног кисеоника, што је резултирало модификацијом дисталнијих остатака хистидина, повећаним радијусом обележавања и могућношћу финог подешавања просторне резолуције ПДПЛ.Такође смо тестирали седам хемијских сонди да бисмо повећали однос сигнала и позадине и истражили молекуларни механизам који стоји иза овог приступа.ТОП-АБПП ток рада у комбинацији са непристрасним отвореним претраживањем потврдио је да су се модификације догодиле само у хистидинима и да није примећено конзистентно микроокружење за повећане модификације хистидина, осим умерене преференције за хистидине у региону петље.
ПДПЛ је такође коришћен за карактеризацију субцелуларних протеома са специфичношћу протеома и покривеношћу која је барем упоредива са другим методама обележавања близине и методама хемијске сонде специфичне за органеле.Маркери близине су такође успешно коришћени за карактеризацију површинских, лизозомалних и протеома повезаних са секретомом46,47.Верујемо да ће ПДПЛ бити компатибилан са овим субцелуларним органелама.Поред тога, изазвали смо ПДПЛ тако што смо идентификовали циљеве за везивање цитосолног протеина који су сложенији од протеина везаних за мембрану због њихових динамичких својстава и учешћа у више временских интеракција.ПДПЛ је примењен на два протеина, транскрипциони коактиватор БРД4 и лигазу Е3 Паркин повезану са болешћу.Ова два протеина су изабрана не само због њихових основних биолошких функција, већ и због њиховог клиничког значаја и терапеутског потенцијала.За ове две тачке интереса идентификовани су добро познати обавезујући партнери као и нерегистровани циљеви.Значајно је да је протеин СФПК повезан са раздвајањем фаза потврђен ко-ИП, што може указивати на нови механизам којим БРД4 (кратка изоформа) регулише ЛЛПС.Истовремено, верујемо да је идентификација Паркин супстрата сценарио у коме је потребна идентификација индиректних лепкова.Идентификовали смо два неидентификована супстрата паркина и потврдили њихову деградацију дуж пута убиквитинације-протеазома.Недавно је развијена стратегија хватања заснована на механизму за откривање хидролазних супстрата тако што их хватају ензимима.Иако је ово веома моћна метода, није погодна за анализу супстрата укључених у формирање великих комплекса и захтева формирање ковалентних веза између ензима и супстрата.Очекујемо да се ПДПЛ може проширити на проучавање других протеинских комплекса и фамилија ензима, као што су породице деубиквитиназе и металопротеазе.
Нови облик миниСОГ-а, назван СОПП3, је развијен са побољшаном производњом синглетног кисеоника.Упоредили смо миниСОГ са СОПП3 и открили побољшане перформансе означавања, иако је однос сигнал-шум остао непромењен (допунска слика 11).Претпоставили смо да би оптимизација СОПП3 (нпр. кроз усмерену еволуцију) довела до ефикаснијих протеина фотосензибилизатора који захтевају краће светлосно време и на тај начин омогућавају да се ухвате динамичнији ћелијски процеси.Приметно је да је тренутна верзија ПДПЛ ограничена на ћелијско окружење јер захтева осветљење плаве светлости и не може да продре у дубока ткива.Ова карактеристика онемогућава његову употребу у студијама животињских модела.Међутим, комбинација оптогенетике са ПДПЛ могла би пружити прилику за истраживање на животињама, посебно у мозгу.Поред тога, други пројектовани инфрацрвени фотосензибилизатори такође уклањају ово ограничење.Тренутно су у току истраживања у овој области.
Ћелијска линија ХЕК293Т је добијена од АТЦЦ (ЦРЛ-3216).Ћелијска линија је била негативна на инфекцију микоплазмама и култивисана је у ДМЕМ (Тхермо, #Ц11995500БТ) са додатком 10% феталног говеђег серума (ФБС, Вистецх, #СЕ100-Б) и 1% пеницилина/стрептомицина (Хицлоне, #СВ30010).одрастао у.
3-Аминофенилен (узорак 3) и (4-етинилфенил)метанамин (узорак 4) су набављени од Бидепхарма.Пропиламин (сонда 2) је купљен од Енерги-цхемицалс.Н-(2-Аминофенил)пент-4-инамид (сонда 1) је синтетизован према објављеним методама.
Додатна табела 1 наводи генетске конструкције коришћене у овој студији.МиниСОГ и КиллерРед секвенце су клониране из поклон плазмида са П. Зоу (Пекиншки универзитет).Циљна секвенца митохондријалног матрикса изведена је из 23 Н-терминалне аминокиселине ЦОКС4 и клонирана у назначене векторе коришћењем Гибсоновог склопа (Беиотиме, #Д7010С).Да би се циљала мембрана и језгро ендоплазматског ретикулума, СЕЦ61Б људска ДНК (НМ_006808.3) (НЕБ, #М0491Л) амплифицирана ПЦР-ом из цДНК библиотеке ћелија ХЕК293Т и Х2Б ДНК (донирала Д. Лин, Схензхен Баи Лаборатори) и клонирани, као што је горе поменуто.Осим ако није другачије назначено, други протеински гени који се користе за трансфекцију и изградњу стабилних ћелијских линија су ПЦР амплификовани из библиотеке цДНК ћелија ХЕК293Т.Г3С (ГГГС) и Г4С (ГГГГС) су коришћени као линкери између протеина мамаца и миниСОГ.Ознака епитопа В5 (ГКПИПНПЛЛГЛДСТ) додата је овим фузионим конструктима.За експресију код сисара и успостављање стабилне ћелијске линије, миниСОГ фузиони конструкт је субклониран у пЛКС304 лентивирусни вектор.За експресију бактерија, миниСОГ је клониран у пЕТ21а вектор обележен 6кХис на Ц-терминусу.
ХЕК293Т ћелије су засејане са 2,0 к 105 ћелија по бунарчићу у плоче са шест бунарчића и трансфектоване 24 сата касније са рекомбинантним лентивирусним плазмидима (2,4 μг пЛКС304) и плазмидима за паковање вируса (1,5 μг псПАКС2 и 1,2 μг псПАКС2 и 1,2 μг п. , #Ц0533), око 80% фузије.После трансфекције преко ноћи, медијум је промењен и инкубиран још 24 сата.Сакупљање вируса је обављено након 24, 48 и 72 сата.Пре инфекције циљних ћелијских линија, вирусни медијум је филтриран кроз филтер од 0,8 μм (Мерцк, #миллек-ГП) и додат је полибрен (Соларбио, #Х8761) до концентрације од 8 μг/мл.После 24 сата, ћелије су остављене да се опораве променом медијума.Ћелије су одабране коришћењем 5 μг/мл бластицидина (Соларбио, #3513-03-9) за прва три пасуса као нижи строги избор.Затим се користи 20 μг/мл као строжи режим за следећа три пасуса.
Ћелије су засејане у коморе са 12 бунарчића (Ибиди, #81201) при густини од приближно 20.000 ћелија по бунарчићу.Да бисте побољшали адхезију ћелија ХЕК293Т, додајте 50 µг/мл фибронектина (Цорнинг, #356008) разблаженог у физиолошком раствору са фосфатним пуфером (ПБС, Сангон, #Б640435) на 37°Ц.Коморе су претходно третиране 1 сат и затим уклоњене са ПБС.После 24 х, ћелије су једном испране ПБС-ом, инкубиране са 1 мМ сондом 3 у свежем Ханксовом избалансираном раствору соли (ХБСС, Гибцо, # 14025092) током 1 х на 37 ° Ц, а затим инкубиране са плавом ЛЕД диодом (460 нм). ).) зрачени су 10 минута на собној температури.Након тога, ћелије су испране два пута са ПБС и фиксиране са 4% формалдехида у ПБС (Сангон, #Е672002) током 15 минута на собној температури.Вишак формалдехида је уклоњен из фиксираних ћелија испирањем три пута са ПБС.Ћелије су затим пермеабилизоване са 0,5% Тритон Кс-100 (Сангон, #А600198) у ПБС и испране 3 пута са ПБС.Затим уклоните комору и додајте у сваки узорак 25 µл реакционе смеше клика која садржи 50 µМ Ци3-азида (Аладдин, #Ц196720), 2 мМ ЦуСО4 (Сангон, #А603008), 1 мМ БТТАА (Цонфлуоре, #БДЈ-4) и 0,5 мг/мл натријум аскорбата (Аладдин, бр. С105024) и инкубирано 30 минута на собној температури.После брзе реакције, ћелије су испране шест пута са ПБС који садржи 0,05% Твеен-20 (Сангон, #А600560) (ПБСТ), а затим блокиране са 5% БСА (Абцоне, #Б24726) у ПБСТ током 30 минута на собној температури.
За колокализационо имунолошко бојење, ћелије су инкубиране са примарним антителима у складу са назначеним условима: мишји анти-В5 таг мАб (1:500, ЦСТ, #80076), зечји анти-Хсп60 мАб (1:1000), АБцлонал, #А0564), зечје поликлонско анти-калнексинско антитело (1:500, Абцам, #аб22595) или зечје анти-ламин А/Ц моноклонско антитело (1:500; ЦСТ, #2032) на 4 °Ц преко ноћи.После прања 3 пута са ПБСТ, ћелије су инкубиране са секундарним антителима: козји анти-зечји Алека Флуор 488 (Тхермо, #А11034) разблажен 1:1000, козји анти-миш Алека Флуор 594 ​​(ЦСТ, #8889) разблажен 1:1000.разблаживање Разблажити на собној температури 30 минута.Ћелије су затим испране 3 пута са ПБСТ и обојене са ДАПИ (Тхермо, #Д1306) у ПБС током 10 минута на собној температури.После 3 испирања са ПБС, ћелије су запечаћене у 50% глицерола (Сангон, # А600232) у ПБС за снимање.Имунофлуоресцентне слике су добијене коришћењем конфокалног микроскопа ЗЕИСС ЛСМ 900 Аирисцан2 и софтвера ЗНЕ 3.5.
За флуоресцентно снимање синглетног кисеоника, ћелије су два пута испране Ханкс ХЕПЕС пуфером пре додавања 100 нМ Си-ДМА у Ханкс ХЕПЕС пуфер (ДОЈИНДО, # МТ05).После излагања светлости, ћелије су инкубиране у ЦО2 инкубатору на 37°Ц током 45 минута.Ћелије су затим испране два пута са Ханксовим ХЕПЕС пуфером и обојене са Хоецхстом у Ханксовом ХЕПЕС пуферу 10 минута на собној температури и визуелизоване коришћењем ЗЕИСС ЛСМ 900 конфокалног микроскопа., #М36008) у ХБСС пуферу који садржи калцијум и магнезијум.После излагања светлости или доксорубицину (МЦЕ, #ХИ-15142А), ћелије су инкубиране у ЦО2 инкубатору на 37°Ц током 10 минута, испране два пута са ХБСС пуфером и инкубиране са Хоецхстом у ХБСС пуферу на собној температури.минута.Доксорубицин је коришћен као позитивна контрола сонде где су ћелије третиране са 20 μМ доксорубицина у ХБСС који садржи 1% БСА током 30 минута.Имунофлуоресцентне слике су добијене коришћењем Зеисс ЛСМ 900 конфокалног микроскопа.
ХЕК293Т ћелије које стабилно експримирају мито-миниСОГ су засејане у густини од приближно 30% у посудама од 15 цм.Након 48 сати, када је постигнуто ~80% конфлуенције, ћелије су једном испране ПБС-ом, инкубиране са 1 мМ сондом 3 у свежем ХБСС пуферу 1 сат на 37°Ц, а затим осветљене плавом ЛЕД диодом 10 минута у соби. температура..Након тога, ћелије су два пута испране са ПБС, остругане и ресуспендоване у ледено хладном ПБС пуферу који садржи инхибиторе протеазе без ЕДТА (МЦЕ, #ХИ-К0011).Ћелије су лизиране соникацијом врха током 1 минута (1 секунда укључена и 1 секунда искључена при 35% амплитуде).Добијена смеша је центрифугирана на 15,871 кг током 10 минута на 4°Ц да би се уклонили остаци, а концентрација супернатанта је подешена на 4 мг/мЛ коришћењем комплета за анализу БЦА протеина (Беиотиме, #П0009).Комбинујте 1 мл горњег лизата са 0,1 мМ фоторазградивог биотин азида (Цонфлуоре, #БББД-14), 1 мМ ТЦЕП (Сангон, # А600974), 0,1 мМ ТБТА лиганда (Аладдин, #Т162437) и 1 мМ ЦуСО4 инцубМ лиганда ротирати 1 сат на собној температури.Након брзе реакције, додајте смешу у претходно помешани раствор (МеОХ:ЦХЦл3:Х2О = 4 мл:1 мл:3 мл) у стакленој бочици од 10 мл.Узорци су помешани и центрифугирани на 4500 г током 10 минута на собној температури.Доњи и горњи раствори су одбачени, талог је два пута испран са 1 мл метанола и центрифугиран на 15871 × г током 5 минута на 4 ° Ц.Додати 1 мл 8 М урее (Аладдин, бр. У111902) у 25 мМ амонијум бикарбоната (АБЦ, Аладдин, бр. А110539) да бисте растворили талог.Узорци су реконституисани са 10 мМ дитиотреитола (Сангон, #А100281 у 25 мМ АБЦ) током 40 минута на 55°Ц, након чега је додат 15 мМ свежег јодоацетамида (Сангон, #А600539) на собној температури у мраку.Алкилација у року од 30 минута..Додатних 5 мМ дитиотреитола је додато да се реакција заустави.Припремите приближно 100 µл НеутрАвидин агарозних куглица (Тхермо, #29202) за сваки узорак испирањем 3 пута са 1 мл ПБС.Горњи раствор протеома је разблажен са 5 мл ПБС и инкубиран са претходно испраним зрнцима НеутрАвидин агарозе током 4 сата на собној температури.Перле су затим испране 3 пута са 5 мл ПБС који садржи 0,2% СДС (Сангон, #А600485), 3 пута са 5 мл ПБС који садржи 1М уреу, и 3 пута са 5 мл ддХ2О.Перле су затим сакупљене центрифугирањем и ресуспендоване у 200 μл 25 мМ АБЦ који садржи 1 М уреу, 1 мМ ЦаЦл 2 (Мацклин, # Ц805228) и 20 нг/μл трипсина (Промега, # В5280).Трипсинизовати преко ноћи на 37°Ц уз ротацију.Реакција је заустављена додавањем мравље киселине (Тхермо, # А117-50) све док пХ није достигао 2-3.Перле су испране 3 пута са 1 мл ПБС који садржи 0,2% СДС, 3 пута са 1 мл ПБС који садржи 1 М уреу, а затим 3 пута са 1 мл дестиловане воде.Модификовани пептиди су ослобођени светлосном лизом (365 нм) током 90 мин коришћењем 200 μл 70% МеОХ.Након центрифугирања, супернатант је сакупљен.Перле су затим једном испране са 100 μл 70% МеОХ и супернатанти су спојени.Узорци су сушени у Спеедвац вакуум концентратору и чувани на -20°Ц до анализе.
Да би се идентификовали и квантификовали синглет кисеоником модификовани пептиди, узорци су поново растворени у 0,1% мравље киселине и 1 μг пептида је анализирано коришћењем Орбитрап Фусион Лумос Трибрид масеног спектрометра опремљеног нано ЕСИ извором из Туне и Ксцалибур софтвера добављача 4.3.Узорци су раздвојени на капиларној колони величине 75 µм × 15 цм са унутрашње стране са 3 µм Ц18 материјалом (РепроСил-пур, #р13.б9.) и повезани на ЕАСИ-нЛЦ 1200 УХПЛЦ систем (Тхермо).Пептиди су раздвојени линеарном хроматографијом у градијенту од 95 минута од 8% растварача Б до 50% растварача Б (А = 0,1% мравља киселина у води, Б = 0,1% мравља киселина у 80% ацетонитрила), а затим линеарно повећана на 98% Б мин. за 6 мин при брзини протока од 300 нл/мин.Орбитрап Фусион Лумос прикупља податке наизменично између потпуног МС скенирања и МС2 скенирања у зависности од података.Напон распршивања је подешен на 2,1 кВ, а температура капиларе за транспорт јона је била 320°Ц.МС спектри (350-2000 м/з) су прикупљени са резолуцијом од 120 000, АГЦ 4 × 105 и максималним улазним временом од 150 мс.10 најчешћих вишеструко наелектрисаних прекурсора у сваком пуном скенирању је фрагментовано коришћењем ХЦД са нормализованом енергијом судара од 30%, квадруполним изолационим прозором од 1,6 м/з и поставком резолуције од 30.000.АГЦ циљ за тандем масену спектрометрију користећи 5×104 и максимално улазно време 150 мс.Динамички изузетак је подешен на 30 секунди. Недодијељени јони или они са набојем од 1+ и >7+ су одбијени за МС/МС. Недодијељени јони или они са набојем од 1+ и >7+ су одбијени за МС/МС. Неназначени иони или иони с зарадом 1+ и >7+ били отклонени дла МС/МС. Недодијељени јони или јони са набојем од 1+ и >7+ су одбијени за МС/МС.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于МС/МС。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于МС/МС。 Неуказанние иони или иони с зарадами 1+ и >7+ били отклонени дла МС/МС. Неспецификовани јони или јони са наелектрисањем од 1+ и >7+ су одбијени за МС/МС.
Необрађени подаци се обрађују помоћу ФрагПипе рачунарске платформе засноване на МСФраггер-у.Одступања масе и одговарајуће аминокиселине су одређене коришћењем отвореног алгоритма претраге са толеранцијом масе прекурсора од -150 до 500 Да.Модификовани пептиди су затим идентификовани коришћењем модификација хистидина са повећањем масе од +229,0964 и +247,1069 Да у ПД (Протеоме Дисцоверер 2.5, Тхермо).
Ћелије које стабилно експримирају фузионисани миниСОГ ген су постављене у посуде од 6 цм.По достизању ~80% конфлуенције, ћелије су једном испране са ХБСС (Гибцо, # 14025092), затим инкубиране са хемијским сондама у ХБСС током 1 сата на 37 ° Ц и осветљене плавим светлом.10В ЛЕД 20 минута на собној температури.Да би се утврдило која врста реактивних врста кисеоника је укључена у ПДПЛ, 0,5 мМ витамина Ц (МЦЕ, #ХИ-Б0166), 5 мМ Тролок (МЦЕ, #ХИ-101445), Д2О (Сигма, #7789-20-0), 100 мМ манитола (Енерги Цхемицал, #69-65-8), 100 μМ Х2О2, 10 мМ НаН3 додато је ћелијама као суплементи.После испирања хладним ПБС-ом, ћелије су остругане, сакупљене у епрувете за центрифугирање од 1,5 мл и соникиране врхом 1 мин у 200 μл ПБС-а са 1к инхибитором протеазе без ЕДТА (1 с и 1 с без, амплитуда 35%).Добијена смеша је центрифугирана на 15,871 × г током 10 минута на 4 °Ц и концентрација супернатанта је подешена на 1 мг/мЛ коришћењем комплета за анализу БЦА протеина.Приближно 50 µл горњег лизата је инкубирано са 0,1 мМ родамин азида (Аладдин, бр. Т131368), 1 мМ ТЦЕП, 0,1 мМ ТБТА лиганда и 1 мМ ЦуСО4 током 1 сата од доње до горње температуре са ротирањем.Након реакције клика, обављено је таложење ацетоном додавањем 250 μл претходно охлађеног ацетона у узорке, инкубирањем на -20 ° Ц током 20 минута и центрифугирањем на 6010 × г током 10 минута на 4 ° Ц.Сакупити пелет и кувати у 50 µл 1к Лаеммлијевог пуфера 10 минута на 95 °Ц.Узорци су затим анализирани на СДС-ПАГЕ дугим геловима и визуелизовани коришћењем Био-рад ЦхемиДоц МП Тоуцх система за снимање са софтвером Имаге Лаб Тоуцх.
Експресија и пречишћавање рекомбинантног миниСОГ-6кХис протеина изведено је као што је претходно описано.Укратко, ћелије Е. цоли БЛ21(ДЕ3) (ТрансГен, #ЦД701-02) су трансформисане са пЕТ21а-миниСОГ-6кХис и експресија протеина је индукована са 0,5 мМ ИПТГ (Сангон, #А600168).После ћелијске лизе, протеини су пречишћени коришћењем Ни-НТА агарозних куглица (МЦЕ, бр. 70666), дијализовани против ПБС-а и чувани на –80°Ц.
За ин витро тест близине обележивача заснован на антителима, помешајте 100 μМ пречишћеног миниСОГ, 1 мМ сонде 3 и 1 μг анти-лабел мишјег моноклонског антитела (ТрансГен, #ХТ501-01) у ПБС до укупне реакционе запремине од 50 μл..Реакциона смеша је озрачена плавим ЛЕД светлом током 0, 2, 5, 10 и 20 минута на собној температури.Смеша је инкубирана са 0,1 мМ биотин-ПЕГ3-азида (Аладдин, #Б122225), 1 мМ ТЦЕП, 0,1 мМ ТБТА лиганда и 1 мМ ЦуС04 током 1 х на собној температури на мућкалици са покретом нагоре.Након брзе реакције, додати 4к Лаеммлијев пуфер директно у смешу и кувати на 95°Ц 10 мин.Узорци су анализирани на СДС-ПАГЕ геловима и анализирани Вестерн блоттингом са стрептавидином-ХРП (1:1000, Соларбио, #СЕ068).
Синтетички пептид који садржи хистидин са Ц-терминалном амидацијом (ЛХДАЛДАК-ЦОНХ2) је коришћен за анализу ин витро обележавања на бази пептида у близини.У овом тесту, 100 μМ пречишћеног миниСОГ, 10 мМ сонде 3 и 2 μг/мл синтетичког пептида помешани су у ПБС у укупној реакционој запремини од 50 μл.Реакциона смеша је озрачена плавим ЛЕД светлом 1 сат на собној температури.Један микролитар узорка је анализиран коришћењем ЛЦ-МС система (Ватерс, СИНАПТ КСС Ионс Мобилити Тиме-оф-Флигхт масени спектрометар са МассЛинк софтвером за анализу спектра).
ХЕК293Т ћелије које стабилно експримирају миниСОГ фузиони ген су засејане у посуде од 10 цм за линије са различитим локализацијама органела (Мито, ЕР, Нуцлеус) и посуде од 15 цм за Паркин-миниСОГ и БРД4-миниСОГ линије.По достизању ~90% конфлуенције, ћелије су једном испране са ХБСС, затим инкубиране са сондом 3 у ХБСС током 1 сата на 37 ° Ц и осветљене плавом ЛЕД диодом од 10 В на собној температури.За бесконтактно обележавање Паркина, 10 µМ протон карбонил цијанид носач м-хлорофенилхидразон ЦЦЦП (Соларбио, #Ц6700) са сондом 3 у ХБСС је додат 1 сат на 37°Ц.Лиза ћелија, хемија клика, редукција и кораци алкилације били су исти као што је горе описано, осим што је додато 2 мг лизата и биотин ПЕГ3 азид је коришћен у реакцији клика уместо фоторазградивог биотин азида.Након обогаћивања, куглице су испране 3 пута са 5 мл ПБС који садржи 0,2% СДС, 3 пута са 5 мл ПБС који садржи 1 М уреу и 3 пута са 5 мл ПБС.Након тога, 2 µг трипсина је додато у 300 µл 25 мМ АБЦ који садржи 1 М уреу да би се протеин цепао преко ноћи на 37°Ц.Реакција је заустављена додавањем мравље киселине док се не постигне пХ од 2-3.После трипсинизације на куглицама, раствор пептида је одсољен коришћењем СОЛАµ ХРП колоне (Тхермо, #60209-001) и осушен у Спеедвац вакуум концентратору.Пептиди су поново растворени у 0,1% мравље киселине и 500 нг пептида је анализирано коришћењем Орбитрап Фусион Лумос Трибрид масеног спектрометра опремљеног нано-ЕСИ извором описаним горе.Пептиди су раздвојени на комерцијалним РП-ХПЛЦ предколонама (75 μм к 2 цм) (Тхермо, бр. 164946) и аналитичким РП-ХПЛЦ колонама (75 μм к 25 цм) (Тхермо, бр. 164941), обе испуњене са 2 μм.градијент од 8% до 35% АЦН за 60 минута, затим линеарно повећан на 98% Б за 6 минута при брзини протока од 300 Нл/мин.МС спектри (350-1500 м/з) су сакупљени са резолуцијом од 60.000, АГЦ 4 × 105 и максималним улазним временом од 50 мс.Одабрани јони су секвенцијално фрагментисани помоћу ХЦД у циклусима од 3 с са нормализованом енергијом судара од 30%, квадруполним изолационим прозором од 1,6 м/з и резолуцијом од 15000. АГЦ циљ тандем масеног спектрометра 5 × 104 и максимално време убризгавања коришћено је 22 мс.Динамичко изузимање је подешено на 45 секунди. Недодијељени јони или они са набојем од 1+ и >7+ су одбијени за МС/МС. Недодијељени јони или они са набојем од 1+ и >7+ су одбијени за МС/МС. Неназначени иони или иони с зарадом 1+ и >7+ били отклонени дла МС/МС. Недодијељени јони или јони са набојем од 1+ и >7+ су одбијени за МС/МС.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于МС/МС。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于МС/МС。 Неуказанние иони или иони с зарадами 1+ и >7+ били отклонени дла МС/МС. Неспецификовани јони или јони са наелектрисањем од 1+ и >7+ су одбијени за МС/МС.
Кораци припреме узорка до обогаћивања зрна НеутрАвидина били су исти као у горе описаној ЛЦ-МС/МС анализи.Приближно 50 μг лизата је коришћено као улаз за контролу оптерећења, а 2 мг лизата је коришћено за реакције клика.После обогаћивања и испирања неутравидином, везани протеини су елуирани додавањем 50 μл Лаеммлијевог пуфера у куглице агарозне смоле и кључањем на 95°Ц током 5 минута.Узорци контролног оптерећења и обогаћени зрнцима анализирани су помоћу СДС-ПАГЕ и пребачени на ПВДФ мембране (Миллипоре, #ИСЕК00010) стандардним Вестерн блот методама.Мембране су блокиране са 5% обраног млека (Сангон, #А600669) у ТБС који садржи 0,1% твеен-20 (ТБСТ) и инкубиране су узастопно са примарним и секундарним антителима.Примарна антитела су разблажена 1:1000 у 5% обраном млеку у ТБСТ и инкубирана преко ноћи на 4°Ц.Секундарна антитела су коришћена у односу 1:5000 и инкубирана 1 сат на собној температури.Мембране су визуелизоване хемилуминисценцијом коришћењем Цхемидоц МП система за снимање.Сви необрезани скенови мрља и гелова на слици су представљени као необрађени подаци.
Примарна антитела коришћена у овој студији укључивала су зечје анти-СФПК моноклонско антитело (ЦСТ, бр. 71992), зечје анти-ФУС моноклонско антитело (ЦСТ, бр. 67840), зечје анти-НСУН2 поликлонско антитело (Протеинтецх, бр. 20854-1- АП), зечје анти-мСин3А поликлонско антитело (Абцам, #аб3479), мишје анти-таг моноклонско антитело (ТрансГен, #ХТ201-02), мишје анти-β-актин моноклонско антитело (ТрансГен, #ХЦ201-01), зечје антитело -ЦДК2 моноклонско антитело (АБцлонал, #А0094), зечје моноклонско антитело на ЦТБП1 (АБцлонал, #А11600), зечје поликлонско антитело на ДУТ (АБцлонал, #А2901), зечје поликлонско антитело на ПСМЦ4 (АБ250) ДНАЈБ1 поликлонско антитело (АБцлонал, # А5504).Ова антитела су коришћена у разблажењу 1:1000 у 5% обраног млека у ТБСТ.Секундарна антитела коришћена у овој студији укључивала су анти-зечји ИгГ (ТрансГен, #ХС101-01), анти-мишји ИгГ (ТрансГен, #ХС201-01) у разблажењу 1:5000.
Да би се даље истражило да ли БРД4 ступа у интеракцију са СФПК, стабилне ћелије ХЕК293Т и БРД4-миниСОГ које прекомерно експримирају ХЕК293Т стављене су у посуде од 10 цм.Ћелије су испране хладним ПБС и лизиране у 1 мл Пиерце ИП пуфера за лизу (Тхермо Фисхер, #87787) са инхибитором протеазе без ЕДТА током 30 минута на 4°Ц.Након тога, лизати су сакупљени у епрувете за центрифугирање од 1,5 мл и центрифугирани на 15,871 кг током 10 минута на 4°Ц.Супернатант је сакупљен и инкубиран са 5 уг анти-В5 обележеног мишјег моноклонског антитела (ЦСТ, #80076) преко ноћи на 4°Ц.Исперите приближно 50 µл протеинских А/Г магнетних куглица (МЦЕ, #ХИ-К0202) двапут са ПБС-ом који садржи 0,5% Твеен-20.Затим су ћелијски лизати инкубирани са магнетним перлама током 4 сата на 4°Ц са ротацијом одоздо према горе.Затим су перле четири пута испране са 1 мл ПБСТ пуфера и куване на 95 ° Ц током 5 мин.Узорци су анализирани на СДС-ПАГЕ геловима и пребачени на ПВДФ мембране коришћењем стандардних Вестерн блот метода.Мембране су блокиране у 5% обраног млека у ТБСТ и инкубиране узастопно са примарним и секундарним антителима.Примарно антитело Зечје анти-СФПК моноклонско антитело (ЦСТ, #71992) је коришћено у односу 1:1000 у 5% обраном млеку у ТБСТ и инкубирано преко ноћи на 4°Ц.Анти-зечји ИгГ је коришћен у односу 1:5000 и инкубиран 1 сат на собној температури.Мембране су визуелизоване хемилуминисценцијом коришћењем Цхемидоц МП система за снимање.
Све структуре коришћене за анализу површине приступачне растварачу (САСА) добијене су из Протеин Дата Банк (ПДБ)52 или АлпхаФолд Протеин Струцтуре Датабасе53.Апсолутни САСА је израчунат за сваки остатак коришћењем програма ФрееСАСА.Само потпуни и недвосмислени САСА подаци за обележени хистидин и његове суседе коришћени су за добијање средње вредности САСА за сваку структуру.Релативна доступност растварача (РСА) за сваки хистидин је израчуната дељењем апсолутне вредности САСА са емпиријском максималном могућом површином остатка која је доступна растварачу.Сви хистидини су затим класификовани као скривени ако је средња вредност РСА била испод 20%, иначе изложени56.
Сирови фајлови добијени у ДДА режиму су претражени помоћу Протеоме Дисцоверер-а (в2.5) или МСфраггер-а (Фрагпипе в15.0) у одговарајућој СвиссПрот верификованој бази протеина која садржи уобичајене контаминанте.Пептиди су захтевали комплетан трипсин са два места цепања која недостају, карбамоил метилацијом као фиксном модификацијом и оксидацијом метионина као динамичком модификацијом.Толеранције тежине прекурсора и фрагмента су постављене на 10 ппм и 0,02 Да (МС2 Орбитрап), респективно. Погоци загађивача су уклоњени, а протеини су филтрирани да би се добила стопа лажног откривања од <1%. Погоци загађивача су уклоњени, а протеини су филтрирани да би се добила стопа лажног откривања од <1%. Попаданиа загразнаусих весества били удалени, а белки отфильтровани, чтоби получить коефициент ложного откривениа <1%. Погоци загађивача су уклоњени, а протеини филтрирани да би се добила стопа лажне детекције од <1%.去除污染物命中,过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попаданиа загразнаусих весества били удалени, а белки отфильтровани дла достигне уровна ложних откривениј <1%. Погоци загађивача су уклоњени, а протеини филтрирани да би се постигла стопа лажних позитивних резултата од <1%.За квантитативну анализу без употребе ознака коришћен је нормализован садржај протеина из три биолошка понављања.Анализа субћелијске локализације протеина је извршена коришћењем анализе генске онтологије (ГО) из ДАВИД Биоинформатицс Ресоурцес, МитоЦарта 3.0 и база података које је саставила и објавила група Алице Тинг.Мапа вулкана је добијена од Персеја (в1.6.15.0). Промене набора у обиљу протеина су тестиране на статистичку значајност коришћењем двостраног т-теста, а погоци протеина су идентификовани са променом заступљености >2 (осим ако није другачије наведено) и п вредношћу <0,05. Промене набора у обиљу протеина су тестиране на статистичку значајност коришћењем двостраног т-теста, а погоци протеина су идентификовани са променом заступљености >2 (осим ако није другачије наведено) и п вредношћу <0,05. Изменениа кратности содержаниа белка биле проверене на статистичку значајность с использованием двусторонного т-критерије, и совпадениа белкови биле идентификоване с изменениами содержаниа> 2 (если није указано иное) и значением п <0,05. Промене набора садржаја протеина су тестиране на статистичку значајност коришћењем двостраног т-теста, а подударања протеина су идентификована са променом садржаја >2 (осим ако није другачије назначено) и ап вредношћу <0,05.使用 双边 双边 测试 蛋白质 丰度 倍数 倍数 的 统计 统计 并 并 命 命 中 中 的 中 中 的 的 中 的 的 的 (除非 另 有 说明) 和 п 值 <0,05.使用 双边 检验 测试 蛋白质 倍 数 数 的 显着性 显着性 并 蛋白质 命 命 命 命 命 中> 2 (另 有 说明) 和 п 值 <0,05. Статистическаа значајность кратних изменениј содержаниа белка проверава с использованием двусторонного т-критериа, а совпадениа белк определает дла содержаниа >2 (если не указано иное) и п-значениа <0,05. Статистичка значајност нагомиланих промена у садржају протеина је тестирана коришћењем двостраног т-теста, а подударања протеина су одређена за промене садржаја >2 (осим ако није другачије назначено) и п-вредности <0,05.Анализа интеракције протеина је извршена коришћењем ГО анализе заједно са базом података Стринг.
Изведене су три биолошке реплике са сличним резултатима.Статистичка анализа је урађена са ГрапхПад Присм (ГрапхПад софтвер) а графикони вулкана су генерисани са Персеусом (в1.6.15.0).Да би се упоредиле две групе, п-вредности су одређене коришћењем двостраног Студентовог т-теста.Само синглетон протеини идентификовани најмање два пута у експерименталној групи укључени су у графиконе вулкана, а одговарајуће недостајуће вредности у контролној групи замењене су са Персеусом из нормалне дистрибуције како би се могла израчунати п-вредност.Траке грешке представљају средњу вредност ± стандардну девијацију.У протеомским анализама за статистичку анализу, задржано је обиље протеина који су се појавили у најмање две биолошке реплике.Статистичке методе нису коришћене за претходно одређивање величине узорка.Експерименти нису случајни.Истраживачи нису били слепи за задатке током експеримента и евалуације резултата.
За више информација о дизајну студије, погледајте сажетак Извештаја о истраживању природе повезан са овим чланком.
Подаци масене спектрометрије добијени у овој студији достављени су Конзорцијуму ПротеомеКсцханге преко иПроКс57 партнерског спремишта под ИД скупа података ПКСД034811 (ПДПЛ-МС скуп података).Необрађени подаци се пружају у облику датотека необрађених података.Овај чланак даје оригиналне податке.
Гинграс, АЦ, Абе, КТ & Раугхт, Б. Упознавање околине: коришћење биотинилације зависне од близине за карактеризацију протеинских комплекса и мапирање органела. Гинграс, АЦ, Абе, КТ & Раугхт, Б. Упознавање околине: коришћење биотинилације зависне од близине за карактеризацију протеинских комплекса и мапирање органела.Гинграс, АС, Абе, КТ и Раут, Б. Познавање околине: коришћење биотинилације зависне од близине за карактеризацију протеинских комплекса и мапирање органела. Гинграс, АЦ, Абе, КТ & Раугхт, Б. Гинграс, АЦ, Абе, КТ & Раугхт, Б. Разумевање суседства: користите зависност суседства од биолошког живота.Гинграс, АС, Абе, КТ и Раут, Б. Разумевање близине: карактеризација протеинских комплекса и мапирање органела коришћењем биотинилације зависне од близине.Тренутни.Моје мишљење.Хемијски.биологија 48, 44–54 (2019).
Гери, ЈБ ет ал.Мапирање микроокружења преношењем Дектерове енергије на имуне ћелије.Наука 367, 1091–1097 (2020).
Хертлинг, ЕЛ ет ал.Мреже са два протеома откривају ћелијско специфично ремоделирање људског интерактома.Целлс 184, 3022–3040.е3028 (2021).