Вести

Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Верзија претраживача коју користите има ограничену подршку за ЦСС.За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).У међувремену, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказаћемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Ћелије рака су развиле различите механизме да превазиђу ћелијски стрес и наставе да напредују.Протеин киназа Р (ПКР) и њен протеински активатор (ПАЦТ) су почетни реактори који прате различите сигнале стреса који доводе до инхибиције пролиферације ћелије и апоптозе.Међутим, регулација ПАЦТ-ПКР пута у ћелијама рака остаје углавном непозната.Овде смо открили да је дуга некодирајућа РНК (лнцРНА) аспартил тРНА синтетаза антисенс РНК 1 (ДАРС-АС1) директно укључена у инхибицију ПАЦТ-ПКР пута и промовише пролиферацију ћелија рака.Користећи велики функционални скрининг ЦРИСПРи 971 лнцРНА повезане са раком, открили смо да је ДАРС-АС1 повезан са значајно повећаном пролиферацијом ћелија рака.Стога, ДАРС-АС1 нокаут инхибира пролиферацију ћелија и промовише апоптозу ћелија рака у различитим ћелијским линијама рака ин витро и значајно смањује раст тумора ин виво.Механички, ДАРС-АС1 се директно везује за ПАЦТ активациони домен и спречава ПАЦТ-ПКР интеракцију, чиме се смањује активација ПКР, фосфорилација еИФ2α и инхибирање апоптотске ћелијске смрти.Клинички, ДАРС-АС1 је широко изражен код вишеструких карцинома, а прекомерна експресија ове лнцРНА указује на лошу прогнозу.Ова студија разјашњава специфичну регулацију ПАЦТ-ПКР пута помоћу ДАРС-АС1 лнцРНА и пружа још једну мету за прогнозу и лечење рака.
Способност прилагођавања стресу је важна карактеристика преживљавања и пролиферације ћелија рака.Брза пролиферација и метаболичка обележја рака достижу врхунац у тешким микроокружењима – недостатак хранљивих материја, хипоксија и низак пХ – који могу покренути сигналне путеве ћелијске смрти.Дисрегулација гена осетљивих на стрес као што су п535, протеини топлотног шока 6, 7, КРАС8, 9 и ХИФ-110, 11, 12, 13 се често примећују код рака, чиме се блокира апоптоза и подстиче преживљавање.
Протеин киназа Р (ПКР) је важан сензор стреса и подјединица киназе еукариотског иницијационог фактора 2α (еИФ2α), транслационог регулатора који повезује ћелијски стрес са смрћу ћелије.ПКР је првобитно идентификован као антивирусни протеин детекцијом стране дволанчане РНК (дсРНА).Након активације, ПКР фосфорилише еИФ2α да инхибира синтезу вирусних и ћелијских протеина14,15,16.ПАЦТ (ПКР активатор протеин) је идентификован као први ПКР активатор протеин у одсуству дсРНА17,18,19,20,21,22,23.Кроз директну интеракцију са ПКР, ПАЦТ преноси различите стресове (изгладњивање серумом, третман пероксидом или арсенитом) на ПКР и низводне сигналне путеве.Поред фосфорилације еИФ2α, ПАЦТ посредована ПКР активација покреће различите догађаје повезане са одговором на стрес, укључујући измењен редокс статус путем ПИ3К/Акт24 пута, побољшану проверу оштећења ДНК преко п5325,26 и НФ-κБ27,28 Регулише транскрипцију, 29. С обзиром на њихову критичну улогу у одговору на стрес, пролиферацији, апоптози и другим кључним ћелијским процесима, ПКР и ПАЦТ су обећавајући терапеутски циљеви за многе болести, посебно рак30,31,32,33.Међутим, упркос овом плеиотропном функционалном и биолошком значају, регулација ПАЦТ/ПКР активности у ћелијама рака остаје неухватљива.
лнцРНА су транскрипти већи од 200 нуклеотида без потенцијала за кодирање протеина.Пошто су најсавременији пројекти секвенцирања читавог генома идентификовали хиљаде лнцРНА,35,36 уложено је много напора да се разјасне њихове биолошке функције.Све већи број истраживања је показао да су лнцРНА укључене у многе биолошке процесе37 укључујући регулацију инактивације Кс-хромозома38,39, утискивање40, транскрипцију41,42, транслацију43, па чак и раст рака44,45,46,47.Ове студије су известиле да су многе лнцРНА укључене у ПАЦТ/ПКР пут.Једна таква студија је показала да лнцРНА АСПАЦТ инхибира ПАЦТ транскрипцију и повећава нуклеарно задржавање ПАЦТ мРНА.Друге студије су показале да се лнцРНА нц886 везује за ПКР и инхибира његову фосфорилацију49,50.До сада, није пријављена лнцРНА која регулише ПКР активацију посредовану ПАЦТ-ом.
Аспартил-тРНА синтетаза антисенс РНК 1 (ДАРС-АС1) је идентификована као онкогена лнцРНА51,52,53,54.Кроз регулацију миП-194-5п53, миП-12952 и миП-532-3п51, показало се да ДАРС-АС1 промовише раст бистроћелијског карцинома бубрежних ћелија, карцинома штитне жлезде и карцинома плућа не-малих ћелија.Тонг и колеге су такође открили да ДАРС-АС1 промовише прогресију мијелома одржавајући стабилност РНК-везујућег мотива протеина 39 (РБМ39).Међутим, нису спроведене студије о томе да ли је ова лнцРНА укључена у регулацију ПАЦТ-ПКР активације и стресног одговора ћелија рака.
Овде смо извршили велики екран губитка функције користећи ЦРИСПРи систем и утврдили да ДАРС-АС1 лнцРНА промовише пролиферацију неколико типова ћелија рака.Поред тога, идентификовали смо главни механизам: ДАРС-АС1 се везује директно за ПАЦТ, инхибира ПАЦТ и ПКР везивање, спречава фосфорилацију еИФ2α, нижег ПКР супстрата, и на крају инхибира апоптотичку смрт ћелија.У закључку, наш рад открива ДАРС-АС1 лнцРНА као регулатор ПАЦТ-ПКР пута и потенцијалну мету за лечење и прогнозу рака.
Опсежне студије геномског профилисања идентификовале су стотине лнцРНА повезаних са раком.Међутим, њихова функција остаје углавном непозната56.Да бисмо идентификовали обећавајуће кандидате за лнцРНА који су укључени у прогресију рака, извршили смо скрининг губитка функције за смањену пролиферацију у ћелијској линији рака дебелог црева СВ620 користећи ЦРИСПРи систем (слика 1а).Јединствена карактеристика СВ480 и СВ620 ћелијских линија рака дебелог црева је да потичу од примарних и секундарних тумора код једног пацијента.Ово пружа драгоцено поређење за проучавање генетских промена у прогресији узнапредовалог рака дебелог црева.Због тога смо анализирали транскриптоме ћелијских линија колоректалног карцинома (СВ480 и СВ620) коришћењем секвенцирања РНК и сакупили неке потенцијалне функционалне лнцРНА из објављене литературе.На основу ових резултата, дизајнирали смо обједињену библиотеку сгРНА која садржи 7355 сгРНА олигоа који циљају 971 лнцРНА повезаних са раком и 500 нециљаних сгРНА олигоа за негативну контролу (додатни подаци 1).
Шематски приказ скрининга коришћењем система ЦРИСПРи.б сгРНА обогаћивање након скрининга.Хоризонтална испрекидана линија представља лог2 (промена преклопа) = ±0,58.Вертикална испрекидана линија означава п вредност = 0,05.Црне тачке представљају нециљну сгРНА (означена као НЦ).Црвене тачке су сгРНА које циљају ДАРС-АС1.Плаве тачке су сгРНА које циљају ЛИНЦ00205, претходно описану онкогену лнцРНА.фолд промена = (нормализовано очитавање, дан 17)/(нормализовано очитавање, дан 0).ц Нокдаун ДАРС-АС1 сгРНА је инхибирао раст ћелија.Траке грешака представљају ± стандардну девијацију три експеримента.* п ≤ 0,05, ** п ≤ 0,01 двострани Студентов т-тест.д Експресија ДАРС-АС1 у туморима (ТЦГА скуп података).ем Експресија ДАРС-АС1 у упареним нормалним и туморским узорцима пацијената са БЛЦА, КИРЦ, ПРАД, ЛУСЦ, УЦЕЦ, ЛУАД, ЛИХЦ, КИРП и ЦОАД, респективно (ТЦГА скуп података).п-вредности су добијене коришћењем упареног двостраног Студентовог т-теста.
Након конструисања плазмида и паковања лентивируса, трансдуцирали смо дЦас9-СВ620 ћелијску линију колоректалног рака са горњом библиотеком у четири независна експеримента инфекције.Многострукост инфекције (МОИ) за ове инфекције била је 0,1–0,3, што указује да свака ћелија може бити трансфектована само са једном сгРНА.Након 18 дана ин витро културе, профил обогаћивања циљних сгРНК се смањио или повећао након скрининга, док је број нециљаних контролних олигонуклеотида остао релативно непромењен у поређењу са профилом пре скрининга, што указује да наш циљ има високо специфичан скрининг. библиотека.Пиринач.1б и допунска табела 1). ЛИНЦ00205, за који је раније пријављено да промовише прогресију рака плућа и рака јетре58,59,60, је скриниран (лог2 (промена преклопа) < -0,58, п вредност <0,05), потврђујући поузданост овог скрининга (слика 1б). ЛИНЦ00205, за који је раније пријављено да промовише прогресију рака плућа и рака јетре58,59,60, је скриниран (лог2 (промена преклопа) < -0,58, п вредност <0,05), потврђујући поузданост овог скрининга (слика 1б). ЛИНЦ00205, о чему ранее сообсалось, что он подстиче прогресированиу рака легких и рака печени58, 59, 60, бил исклучен (лог2 (кратное измене) <-0,58, вредност п <0,05), что подверждает надежность етого скрининга (рис 1б). ЛИНЦ00205, за који је раније пријављено да промовише напредовање рака плућа и рака јетре58,59,60, искључен је (лог2 (промена пута) <-0,58, п-вредност <0,05, потврђујући робусност овог скрининга (Сл. 1б) . ЛИНЦ00205 之前 被 报道 促进 促进 肺癌 和 肺癌 和 肺癌 和 和 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 被 被 筛 掉 (лог2 (倍数 变化) <-0.58, п 值 <0,05), 证实 了 该 筛选 的 证实 (图 1б). ЛИНЦ00205 之前 被 报道 促进 促进 肺癌 和 肺癌 和 肺癌 和 和 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 被 被 筛 掉 (лог2 (倍数 变化) <-0.58, п 值 <0,05), 证实 了 该 筛选 的 证实 (图 1б). ЛИНЦ00205, о ранеее сообсалось, что он доприноси прогресированиу рака легких и печени58, 59, 60, бил исклучен (лог2 (кратное измене) <-0,58, п-значение <0,05), что подверждает надежность етого скрининга (рис 1б). ЛИНЦ00205, за који је раније пријављено да подстиче прогресију рака плућа и јетре58,59,60, искључен је (лог2 (промена пута) <-0,58, п-вредност <0,05, потврђујући робусност овог скрининга (Сл. 1б).
Међу свим тестираним лнцРНА, ДАРС-АС1 је такође прегледан, са три сродна сгРНА олигонуклеотида значајно смањена након 18 дана културе, што сугерише да је обарање ове лнцРНА резултирало смањеном пролиферацијом рака (слика 1б).Овај резултат је додатно подржан МТС анализом у ћелијама колоректалног рака која показује да је стопа раста ДАРС-АС1 оборених ћелија само преполовљена у поређењу са контролним ћелијама (Слика 1ц) и била је у складу са претходним извештајима о неколико других типова рака.: рак бубрега са чистим ћелијама, рак штитне жлезде и рак плућа не-малих ћелија51,52,53,55.Међутим, његова функција и молекуларни механизми код колоректалног карцинома остају неистражени.Стога смо изабрали ову лнцРНА за даље проучавање.
Да бисмо проучавали експресију ДАРС-АС1 код пацијената, свеобухватно смо анализирали 10.327 узорака тумора из пројекта Атлас генома рака (ТЦГА).Наши резултати показују да је ДАРС-АС1 широко изражен и значајно појачан у здравим ћелијама у различитим туморима, укључујући аденокарцином дебелог црева (ЦОАД), карцином бистрих ћелија бубрега (КИРЦ) и карцином папиларних ћелија бубрега (КИРП)..Врло мало (слика 1д и допунска слика 1а, б). Анализа упарених здравих/туморских узорака даље је потврдила значајно већу експресију ДАРС-АС1 у туморима уротелног карцинома бешике (БЛЦА), карцинома бубрега бубрега са чистим ћелијама (КИРЦ), аденокарцинома простате (ПРАД), карцинома сквамозних ћелија плућа (ЛУСЦ) , карцином ендометријума тела материце (УЦЕЦ), аденокарцином плућа (ЛУАД), хепатоцелуларни карцином јетре (ЛИХЦ), карцином бубрежних папиларних ћелија (КИРП) и аденокарцином дебелог црева (ЦОАД) (п вредност < 0,05) – м (слика 1е) (Слика 1е) . Анализа упарених здравих/туморских узорака даље је потврдила значајно већу експресију ДАРС-АС1 у туморима уротелног карцинома бешике (БЛЦА), карцинома бубрега бубрега са чистим ћелијама (КИРЦ), аденокарцинома простате (ПРАД), карцинома сквамозних ћелија плућа (ЛУСЦ) , карцином ендометријума тела материце (УЦЕЦ), аденокарцином плућа (ЛУАД), хепатоцелуларни карцином јетре (ЛИХЦ), карцином бубрежних папиларних ћелија (КИРП) и аденокарцином дебелог црева (ЦОАД) (п вредност < 0,05) – м (слика 1е) (Слика 1е) .Анализа упарених здравих/туморских узорака такође је потврдила значајно већу експресију ДАРС-АС1 у туморима уротелног карцинома бешике (БЛЦА), карцинома бубрега и бубрежних ћелија (КИРЦ), аденокарцинома простате (ПРАД), карцинома сквамозних ћелија плућа (ЛУСЦ)., карцинома ендометриа тела матки (УЦЕЦ), аденокарцинома легког (ЛУАД), гепатоцелуларнаа карцинома печени (ЛИХЦ), папиларно-клеточнаа карцинома почки (КИРП) и аденокарцинома толстој кишки (ЦОАД) (значење п <0,05) (рис. м) . , карцином ендометријума тела материце (УЦЕЦ), аденокарцином плућа (ЛУАД), хепатоцелуларни карцином јетре (ЛИХЦ), карцином папиларних ћелија бубрега (КИРП) и аденокарцином дебелог црева (ЦОАД) (п вредност < 0,05) (сл. 1е–м).配对 / 肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 ДРС-АС1 (БЛЦА), 肾 肾 透明 细胞癌 (Кирц), 前列 腺腺癌 (ПРАД), 肺鳞状 细胞癌 (Лусц) 肿瘤 中 的 的显着 更 表达, 子宫体子宫 内膜 癌 (уцец), 肺腺癌 (Луад), 肝肝 细胞癌 (лихц), 肾 肾 乳头状 细胞癌 (КИРП) 和结肠腺癌 (цоад) (п 值<0,05） (图1е-м) .配 健康 健康 肿瘤样本 肿瘤样本 的 证实 了 ДРС-ОС1 在 尿路 上 上 皮癌 皮癌 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 (ПРАД), 细胞癌 细胞癌(Лусц) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 显着 高 内膜 内膜 内膜 ((уцел) 肺腺癌 (ЛУАД) 肝肝 细胞癌 (ЛИХЦ) 肾 肾 乳头状 细胞癌 （кирп） (цоад) (п 值<0,05) (图1е-м) .Анализа упарених узорака здравих и тумора додатно је подржала улогу ДАРС-АС1 у туморима уротелног карцинома бешике (БЛЦА), карцинома реналних ћелија бистрих ћелија (КИРЦ), аденокарцинома простате (ПРАД) и карцинома сквамозних ћелија плућа (ЛУСЦ).експрессиа при карциноме тела матки (УЦЕЦ), аденокарциноме легког (ЛУАД), гепатоцелуларној карцином (ЛИХЦ), почечно-почечној папиларно-клеточној карцином (КИРП) и аденокарцином толстој кишки (ЦОАД) (значење п <0,05) (рис. 1е). -м). експресија у корпусном карциному материце (УЦЕЦ), аденокарциному плућа (ЛУАД), хепатоцелуларном карциному (ЛИХЦ), карциному папиларних ћелија бубрега (КИРП) и аденокарциному дебелог црева (ЦОАД) (п вредност <0,05) (Слика 1е -м).Узети заједно, ови резултати показују да је ДАРС-АС1 широко и високо изражен у различитим врстама рака.
Пошто ДАРС-АС1 и ДАРС (ген који кодира антисенсе ланац) деле исти промотор и налазе се један поред другог, дизајнирали смо схРНА да специфично обори ДАРС-АС1, али не и ДАРС (додатна слика 2а, б и додатна табела 2) .Поред СВ620, користили смо и три друге ћелијске линије које су високо експримирале ДАРС-АС1 да бисмо проучавали ефикасност и функцију нокдауна схРНА (додатна табела 3).Наши резултати су показали да су све три развијене схРНА постигле најмање 80% ефикасности уништавања ДАРС-АС1 са малим утицајем на количину ДАРС мРНА (додатна слика 2ц-ф).Поред тога, открили смо да ДАРС-АС1 нокдаун са овим схРНА значајно инхибира раст ћелија у ћелијским линијама колоректалног карцинома СВ620 (49,7%) и ХЦТ116 (27,7%), ћелијске линије рака дојке МБА-МД-231 (53,4%).) и ћелијску линију ХепГ2 хепатома (смањење од 92,7%), као и њихову способност да формирају неусидрене сфере (просечно смањење од ~50,8%, 44,6%, 40,7% и 75,7% по ћелијској линији) (Слика 2а,б).У СВ620, резултати теста формирања колонија даље су потврдили да ДАРС-АС1 схРНА значајно инхибира пролиферацију ћелија са просечним смањењем од приближно 69,6% (слика 2ц).
Ефекат контролне схРНА и ДАРС-АС1 схРНА на ћелијску пролиферацију (а) и формирање сфероида (б) у ћелијама СВ620, ХЦТ116, МБА-МД-231 и ХепГ2.ц Ефекат контролне схРНА и ДАРС-АС1 схРНА на формирање колонија у СВ620 ћелијама.Пролиферација ћелија (д), формирање сфероида (е) и формирање колонија (ф) ћелија СВ620 које прекомерно експримирају ДАРС-АС1.Приказани подаци су средња вредност ± стандардна девијација три експеримента.* п ≤ 0,05, ** п ≤ 0,01 и *** п ≤ 0,001 помоћу двостраног Студентовог т-теста.
Да бисмо допунили студије губитка функције, затим смо креирали ћелије СВ620 које прекомерно изражавају ДАРС-АС1 (додатна слика 2г).Прекомерна експресија ДАРС-АС1 значајно је повећала раст ћелија (1,8 пута), формирање неусклађених сфероида (1,4 пута) и формирање колонија (3,3 пута) у ћелијама СВ620 (Слика 2д-ф).Овај резултат смо потврдили користећи другу ћелијску линију која експримира ДАРС-АС1, А549.Ова појачана ћелијска пролиферација услед прекомерне експресије ДАРС-АС1 даље је примећена у ћелијама А549 (додатна слика 2х, и и додатна табела 3).Узете заједно, ове студије добитка и губитка показују да ДАРС-АС1 промовише пролиферацију ћелија рака ин витро.
Да бисмо истражили основни механизам којим ДАРС-АС1 регулише ћелијску пролиферацију, извршили смо падајућу анализу РНК да бисмо идентификовали његове потенцијалне партнере за везивање протеина.РТ-кПЦР резултати су показали да се око 86,2% ДАРС-АС1 налази у цитоплазми СВ620 ћелија (додатна слика 3а).Ин витро транскрибовани биотиниловани ДАРС-АС1 или псеудоРНА је затим инкубиран са СВ620 ћелијским лизатима након чега је уследило одвајање СДС-ПАГЕ.Накнадно бојење сребром показало је да је различита трака (~38 кДа) значајно обогаћена у ДАРС-АС1 узорцима извлачења, али не и у узорцима лажне РНК или куглица (слика 3а).Ова трака је идентификована као протеин који активира ПКР (ПАЦТ) масеном спектрометријом (МС) и даље потврђена имуноблотингом у ћелијским линијама СВ620, ХЦТ116 и ХепГ2 (слика 3а,б).Обогаћивање ДАРС и сродних ПАЦТ протеина – ПКР и ТРБП – такође је истраживано коришћењем РНК анализе помоћу Вестерн блоттинг (ВБ).Резултати су показали да није пронађена директна интеракција између ДАРС-АС1 РНК и ова три протеина (додатна слика 3б).Специфична интеракција између ДАРС-АС1 и ПАЦТ додатно је потврђена анализом РНК имунопреципитације (РИП), која је показала да је ДАРС-АС1 значајно обогаћен анти-ПАЦТ антителима, али не и другим контролним РНК (слика 3ц).Да би се утврдило да ли ДАРС-АС1 директно ступа у интеракцију са ПАЦТ-ом у одсуству било које друге ћелијске компоненте, изведен је ин витро тест интерферометрије биослоја (БЛИ) коришћењем пречишћеног ПАЦТ-а.ДАРС-АС1 обележена биотином или лажна РНК је имобилизована на стрептавидин (СА) биосензорима, а затим инкубирана у кинетичком пуферу који садржи 1 μМ ПАЦТ.Посебно, ПАЦТ се снажно везао за ДАРС-АС1 (вредност КД ~ 26,9 нМ), али не и за опонашање РНК (слика 3д).Узети заједно, ови резултати показују директну интеракцију и висок афинитет између ДАРС-АС1 и ПАЦТ.
Анализа повлачења РНК идентификовала је ДАРС-АС1 интеракцију са ПАЦТ-ом у СВ620 ћелијама.Изнад, сребрно бојење сродних протеина.Нижи имуноблотови су изведени са анти-ПАЦТ антителом.б РНА пулл-довн анализа је изведена у ћелијама ХЦТ116 (горе) и ХепГ2 (доле).ПАЦТ обогаћивање је откривено имуноблотингом.Испитивања имунопреципитације цРНА (РИП) су изведена у СВ620 ћелијама коришћењем наведених антитела.д ПАЦТ криве везивања за ДАРС-АС1 пуне дужине или контролну РНК добијене су применом биослојне интерферометрије (БЛИ).РНК је имобилисана на стрептавидин биосензору.1 μМ ПАЦТ је коришћен за мерење повезаности.Тест извлачења РНК је изведен коришћењем биотинилованог ДАРС-АС1 пуне дужине или скраћеног (горе).Имуноблот који показује примљен ПАЦТ (доле).ф Пречишћени означени ПАЦТ је инкубиран са биотинилованим ДАРС-АС1 пуне дужине или скраћен (као у е) за ин витро РИП тест.Екстрахована РНК је верификована помоћу РТ-кПЦР.г Релативни афинитет различитих РНК фрагмената за ПАЦТ добијен је применом биослојне интерферометрије.За анализу је коришћено 100 нМ РНК и 1 μМ РАСТ.х Ин витро РИП тестови су изведени коришћењем пречишћеног интактног или скраћеног означеног ПАЦТ-а.Екстрахована РНК је верификована помоћу РТ-кПЦР.и Стопа раста СВ620 ћелија које прекомерно експримирају ДАРС-АС1, ПАЦТ или оба.ј Прекомерна експресија пуне дужине или скраћеног ДАРС-АС1 у СВ620 ћелијама имала је различите ефекте на раст ћелија.к Апоптоза је откривена имуноблотингом са анти-ПАРП антителом.л Нокаут ДАРС-АС1 индукује апоптозу СВ620 ћелија као што је приказано проточном цитометријом.Приказани подаци су средња вредност ± стандардна девијација три експеримента. *п ≤ 0,05, **п ≤ 0,01, ***п ≤ 0,001, ****п < 0,0001, помоћу двостраног Студентовог т теста. *п ≤ 0,05, **п ≤ 0,01, ***п ≤ 0,001, ****п < 0,0001, помоћу двостраног Студентовог т теста. *п ≤ 0,05, **п ≤ 0,01, ***п ≤ 0,001, ****п < 0,0001 по двусторонному критеријуму Стьудента. *п ≤ 0,05, **п ≤ 0,01, ***п ≤ 0,001, ****п < 0,0001 двостраним Студентовим т-тестом. *п ≤ 0,05, **п ≤ 0,01, ***п ≤ 0,001, ****п < 0,0001, 通过双尾学生т 检验。 *п ≤ 0,05, **п ≤ 0,01, ***п ≤ 0,001, ****п < 0,0001, 通过双尾学生т 检验。 *п ≤ 0,05, **п ≤ 0,01, ***п ≤ 0,001, ****п <0,0001 по двусторонному критеријуму Стьудента. *п ≤ 0,05, **п ≤ 0,01, ***п ≤ 0,001, ****п < 0,0001 двостраним Студентовим т-тестом.
Затим смо генерисали три биотинилована ДАРС-АС1 РНК фрагмента ин витро транскрипцијом да идентификујемо ДАРС-АС1 регион потребан за ПАЦТ асоцијацију (слика 3е).Резултати РНК анализе су показали да је сваки фрагмент био у стању да ступи у интеракцију са ПАЦТ-ом, али 3′-терминални регион (384–768 нуклеотида означених А3) показао је више од 1–384 нуклеотида означених А1) (слика 3е).Слични резултати су примећени у ин витро РИП тесту коришћењем рекомбинантног ПАЦТ (Слика 3ф).У складу са овим резултатима, експерименти за везивање имобилизованих РНК фрагмената за ПАЦТ коришћењем БЛИ такође су показали да ПАЦТ има већи афинитет за А3 (384–768 нт) (вредност КД од приближно 94,6 нМ), док скоро да нема веза са другим областима.(слика 3д).
Такође смо испитали повезане регионе везивања у ПАЦТ-у.ПАЦТ садржи три функционална домена, од којих су два конзервирани дволанчани РНК-везујући домени (дсРБД) и трећи домен (означен као Д3) који делује као активатор протеинских интеракција.Да бисмо испитали капацитет везивања лнцРНА сваког домена, направили смо три мутације које су уклониле сваки од три домена и извршили ин витро РИП тест.Наши резултати су показали да је брисање трећег домена (Д3) ПАЦТ значајно смањило његову интеракцију са ДАРС-АС1 (за 0,11 пута у поређењу са интактним ПАЦТ) у поређењу са друге две мутације (слика 3х), показало се да ослобађање од Д3 је био у интеракцији са ДАРС-ом.-АЦ1.Узети заједно, ови резултати сугеришу да се интеракција између ДАРС-АС1 и ПАЦТ може десити првенствено преко 3′ краја ДАРС-АС1 и Д3 домена ПАЦТ-а.
Приметили смо да ДАРС-АС1 није имао утицаја на експресију ПАЦТ, а ПАЦТ није имао утицаја на ДАРС-АС1 (додатна слика 3ц).Затим смо испитали ефекат обарање ПАЦТ-а на раст ћелија.За разлику од ДАРС-АС1, релативне ћелије су расле 1,5-3 пута брже када је ПАЦТ оборен (допунска слика 3д).Резултати анализе формирања колонија показали су да су ћелије формирале 2-3 пута колоније након третмана схРНА са ПАЦТ-ом (додатна слика 3е).Да бисмо тестирали да ли ДАРС-АС1 регулише пролиферацију ћелија кроз ПАЦТ, генерисали смо СВ620 ћелије које прекомерно експримирају ПАЦТ, ДАРС-АС1 или оба.Прекомерна експресија ПАЦТ-а је показала значајну инхибицију пролиферације ћелија (Слика 3и).Док је прекомерна експресија ДАРС-АС1 сама по себи значајно промовисала пролиферацију ћелија, није било значајне разлике у брзини раста ћелија које су прекомерно експримирале ДАРС-АС1 и ПАЦТ.Ови резултати сугеришу да ПАЦТ може да спречи повећану пролиферацију изазвану прекомерном експресијом ДАРС-АС1.
Пошто различити региони ДАРС-АС1 имају различите способности везивања за ПАЦТ, истражили смо њихов релативни утицај на пролиферацију ћелија различитом прекомерном експресијом фрагмената ДАРС-АС1.У поређењу са друга два фрагмента, ДАРС-АС1 је био прекомерно експримиран на 3′ крају (384–768 нт), главном региону везаном за ПАЦТ у ДАРС-АС1, који је имао највећу способност да стимулише пролиферацију ћелија (слика 3ј).Ови резултати указују на позитивну корелацију између капацитета везивања и биолошке функције ДАРС-АС1.
Пријављено је да је ПАЦТ про-апоптотички протеин19.Стога смо истражили ефекат ДАРС-АС1 на апоптозу.Као што се и очекивало, ДАРС-АС1 нокдаун је значајно повећао цепање ПАРП у СВ620 ћелијама и повећао удео анексин В-позитивних ћелија у ћелијским линијама СВ620, ХЦТ116, ХепГ2 и МБА-МД-231 (слика 3к).3).3ф-х), што указује да је анти-апоптотички ефекат ДАРС-АС1 у ћелијама рака супротан функцији ПАЦТ-а која индукује апоптозу.Узети заједно, ови резултати сугеришу да механизам онкогене функције ДАРС-АС1 може бити кроз инхибицију ПАЦТ функције.
Затим смо истражили функционалне импликације асоцијације ДАРС-АС1-ПАЦТ.Пријављено је да ПАЦТ активира ПКР кроз директну интеракцију, што касније појачава фосфорилацију еИФ2α, изазивајући транслациону делецију и апоптозу17.Прво смо испитали да ли ДАРС-АС1 утиче на ћелијску локализацију ПАЦТ и ПКР.Конфокална флуоресцентна микроскопија је показала да су ПАЦТ и ПКР били високо колокализовани у СВ620 ћелијама са просечним Пирсоновим коефицијентом корелације од 0,72.У међувремену, прекомерна експресија ДАРС-АС1 значајно је смањила ПАЦТ и ПКР ко-локализацију (средњи Пирсонов коефицијент корелације 0,61) (Слика 4а).Да бисмо истражили да ли ДАРС-АС1 може модулирати ПАЦТ-ПКР интеракцију, извршили смо тест ко-имунопреципитације (цо-ИП) са анти-ПАЦТ антителом у СВ620 ћелијским лизатима.ПКР је био високо обогаћен анти-ПАЦТ у контролним ћелијама, док је опоравак ПКР значајно смањен у лизатима из ћелија које прекомерно експримирају ДАРС-АС1 (слика 4б).Пречишћени обележени ПАЦТ и ПКР су коришћени за ин витро тестове везивања за протеине.Сходно томе, они који су обезбедили ДАРС-АС1, али нису имали контролну РНК, показали су потиснуту интеракцију ПАЦТ-ПКР (слика 4ц).Сви резултати су показали да је ДАРС-АС1 пореметио ПАЦТ и ПКР комуникацију.
Ко-локализација ПАЦТ и ПКР у контролним ћелијама или ћелијама које прекомерно експримирају ДАРС-АС1 примећена је коришћењем конфокалне флуоресцентне микроскопије.Језгра су обојена ДАПИ.Статистички резултати добијени су на 16 фотографија.б Ко-имунопреципитација (цо-ИП) коришћењем анти-ПАЦТ антитела у ћелијским лизатима контролних ћелија СВ620 или ћелија које прекомерно експримирају ДАРС-АС1.ц Обележени ПАЦТ, пречишћени ПКР и транскрибовани ин витро са ДАРС-АС1 или лажном РНК су инкубирани за ин витро анализу везивања протеина.Анти-флаг антитела су коришћена за имунопреципитацију.д Имуноблотови са назначеним антителима су изведени у ћелијама СВ620 и ХЦТ116 трансфектованим контролном схРНА или ДАРС-АС1-схРНА након чега је уследило гладовање у серуму.Нивои експресије ДАРС-АС1 су променили ћелијску осетљивост на тапсигаргин.СВ620 ћелије су трансфектоване са ДАРС-АС1 схРНА, ДАРС-АС1 плазмидом прекомерне експресије или контролним плазмидом.Ћелије су третиране тапсигаргином током 48 сати, а виталност ћелија је одређена коришћењем МТС реагенса.ф Ин витро транскрибовани ДАРС-АС1 или лажна РНК и пречишћени ПАЦТ су коришћени за ин витро тест активације и детекцију имуноблота.г Имуноблотови коришћењем ових антитела су изведени на СВ620-цтрл ћелијама (лево) или ћелијама које прекомерно експримирају ПКР мутанте (десно).Ове ћелије су затим трансфектоване контролном схРНА или ДАРС-АС1-схРНА након чега је уследило гладовање у серуму.х Проточна цитометрија је показала да је инактивација мутантног ПКР компензовала апоптозу изазвану ДАРС-АС1 у СВ620 ћелијама.и Имуноблотови са назначеним антителима су изведени у СВ620 (лево) или ХЦТ116 (десно) ћелијама.Ћелије трансфектоване контролном схРНА или ДАРС-АС1 схРНА су лишене серума и допуњене су 100 нМ ПКР Ц16 инхибитором или ДМСО.Скала бар = 5 µм.Приказани подаци су средња вредност ± стандардна девијација три експеримента.* п ≤ 0,05 двострани Студентов т-тест.
Генерално се верује да када ПАЦТ ступи у интеракцију са ПКР17, може се индуковати фосфорилација ПКР на Тхр451.Наши резултати су показали да је ниво фосфорилације ПКР значајно повишен у ДАРС-АС1 кноцкдовн ћелијама након гладовања у серуму (слика 4д и додатна слика 4а).Сходно томе, открили смо да је фосфорилација еИФ2α, главног ПКР супстрата, такође значајно повећана ДАРС-АС1 схРНА (слика 4д и додатна слика 4а).Тапсигаргин је ЕР стресор који узрокује да ЕР ослобађа Ца2+.Пријављено је да третман са тапсигаргином изазива експресију и активацију ПАЦТ-а, који даље ступа у интеракцију са и активира ПКР, што доводи до апоптозе повећањем фосфорилације еИФ2α 18,61.Овде смо користили тапсигаргин као стимулатор ПАЦТ/ПКР пута да бисмо истражили да ли ДАРС-АС1 може помоћи ћелијама да превазиђу стрес инхибирањем ПАЦТ/ПКР пута.Приметили смо да је ниво експресије ДАРС-АС1 у позитивној корелацији са отпорношћу ћелија на тапсигаргин.СВ620 ћелије са прекомерном експресијом ДАРС-АС1 боље су преживеле када су третиране тапсигаргином, док су ћелије са обореним ДАРС-АС1 постале осетљивије (слика 4е).У складу са овим резултатима, прекомерна експресија ДАРС-АС1 смањила је фосфорилацију ПКР изазвану тапсигаргином (додатна слика 4б).Насупрот томе, након третмана тапсигаргином, ПКР и еИФ2α су фосфорилисани у већој мери у ДАРС-АС1 кноцкдовн ћелијама у поређењу са контролним ћелијама (додатна слика 4б).Занимљиво је да је тапсигаргин индуковао експресију ДАРС-АС1 на начин зависан од дозе, што може указивати на антистресну функцију ДАРС-АС1 (додатна слика 4ц).Поред тога, извршили смо ин витро тестове активације да бисмо потврдили ова запажања.Укратко, ПКР је пречишћен из ћелијских лизата коришћењем анти-ПКР антитела, затим инкубиран са рекомбинантним ПАЦТ и ДАРС-АС1 транскрибованим ин витро.Након ензимске реакције, фосфо-ПКР је детектован помоћу ВБ.Наши резултати су показали да је фосфорилацију ПКР значајно инхибирао ДАРС-АС1, али не и контролна РНК (слика 4ф).Ови ин витро и ин виво резултати сугеришу да ДАРС-АС1 инхибира ПАЦТ посредовану активацију ПКР.Истовремено, приметили смо и смањење опоравка ПАЦТ-а у присуству ДАРС-АС1 (слика 4ф).Овај резултат је у складу са резултатима ин витро теста везивања за протеине (Слика 4ц) и поново илуструје функцију блокирања ДАРС-АС1 за ПАЦТ-ПКР асоцијацију.
Сер246 и Сер287 у Д3 домену ПАЦТ-а су потребни за активацију ПКР-а под ћелијским стресом.Замена два серинска остатка за аланин дала је мутант ПАЦТ (мутД), који је активирао ПКР у одсуству стреса, а замена за аланин (мутА) је преокренула протокол.Пошто смо показали важност овог домена у директној вези са ДАРС-АС1, генерисали смо ова два ПАЦТ мутанта да бисмо тестирали да ли ови остаци такође могу бити укључени у интеракцију са ДАРС-АС1.Занимљиво је да су оба мутанта изгубила способност везивања за ДАРС-АС1 (допунска слика 4д), што сугерише да би комплетна структура ПАЦТ протеина могла бити потребна за ефикасну интеракцију са ДАРС-АС1.
Штавише, наши резултати такође сугеришу да се инхибиција пролиферације ћелија изазвана ДАРС-АС1-схРНА може делимично обновити прекомерном експресијом доминантног негативног ПАЦТ мутанта (ПАЦТмутА) или доминантног негативног ПКР мутанта (ПКРмут) (додатна слика 4е. е).Прекомерна експресија доминантно-негативних ПКР мутаната смањила је фосфорилацију ПКР индуковану ДАРС-АС1 нокауном, као и фосфорилацију еИФ2α у ћелијама лишеним серума (Слика 4г).Што је још важније, удео апоптотичких ћелија индукованих ДАРС-АС1 нокауном је такође смањен у ћелијама које прекомерно експримирају ПКРмут (слика 4х и додатна слика 4г).Инхибиција активности ПКР киназе такође нарушава функцију ДАРС-АС1, јер су резултати показали да ДАРС-АС1 нокдаун ретко покреће фосфорилацију ПКР и еИФ2α када су ћелије третиране ПКР-специфичним инхибитором Ц16 (слика 4и и додатна слика 4х).).Узети заједно, наши резултати сугеришу да ДАРС-АС1 промовише пролиферацију ћелија, барем делимично, инхибирајући ПАЦТ посредовану активацију ПКР.
Да бисмо даље истражили улогу ДАРС-АС1 у туморигенези, извели смо ин виво експерименте користећи модел мишјег ксенографта. Резултати показују да је нокдаун ДАРС-АС1 драматично смањио раст тумора код мишева (п вредност < 0,0001) (Слика 5а). Резултати показују да је нокдаун ДАРС-АС1 драматично смањио раст тумора код мишева (п вредност < 0,0001) (Слика 5а). Результати показиваут, что нокдаун ДАРС-АС1 резко снижает рост опухоли у мишеј (значение п <0,0001) (рис. 5а). Резултати показују да нокдаун ДАРС-АС1 драстично смањује раст тумора код мишева (п вредност < 0,0001) (Слика 5а).结果表明，ДАРС-АС1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长 (п 值< 0,0001) (图5а)结果表明，ДАРС-АС1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长 (п值<0,0001) (囀5а) Результати показали, что нокдаун ДАРС-АС1 знатно снижает рост опухоли у мишеј (значение р <0,0001) (рис. 5а). Резултати су показали да нокдаун ДАРС-АС1 значајно смањује раст тумора код мишева (п вредност < 0,0001) (Слика 5а).Дакле, у групи која је пала на ДАРС-АС1, дошло је до значајног смањења средњег волумена тумора за око 72,9% и средње масе тумора за око 87,8% (Слика 5б-д).Ови резултати снажно сугеришу да ДАРС-АС1 може значајно подстаћи раст тумора ин виво.
Ефекти обарања огласа ДАРС-АС1 на колоректалну онкогенезу код голих мишева.Приказане су криве раста (а), величина тумора (б), тежина (ц) и слике тумора (д).Траке грешака представљају ±СЕМ. н = 10. ****п < 0,0001, двостраним Студентовим т тестом. н = 10. ****п < 0,0001, двостраним Студентовим т тестом. н = 10. ****п < 0,0001 по двусторонному критеријуму Стьудента. н = 10. ****п < 0,0001 двострани Студентов т-тест.н = 10. ****п < 0,0001,通过双尾学生т 检验。 ****п < 0,0001,通过双尾学生т检验。 ****п < 0,0001 по двусторонному критеријуму Стьудента. ****п < 0,0001 двострани Студентов т-тест.Каплан-Меиер је анализирао корелацију између нивоа експресије ДАРС-АС1 и укупног преживљавања код пацијената са УВМ, КИЦХ, КИРП, МЕСО, ГБМ и ЛГГ.Високи нивои експресије ДАРС-АС1 код пацијената били су у првих 50%;низак ниво експресије ДАРС-АС1 код пацијената био је у доњих 50%.п-вредности су одређене коришћењем лог ранг теста.ф Предложени модел у коме ДАРС-АС1 регулише ПАЦТ-ПКР пут и раст тумора.
Да бисмо боље разумели клинички утицај ДАРС-АС1, испитали смо корелацију између његове експресије и преживљавања пацијената.Анализом скупа података ТЦГА, открили смо да је већа експресија ДАРС-АС1 повезана са увеалним меланомом (УВМ), реналном хромофобијом (КИЦХ), карциномом папиларних ћелија бубрега (КИРП), мезотелиомом (МЕСО), мултиплексом.Ниже преживљавање је значајно повезано са морфозом глиобластома (ГБМ) и пацијентима са глиомом мозга ниског степена (ЛГГ) (Слика 5е).Ови резултати сугеришу да ДАРС-АС1 може играти важну улогу у клиничкој прогресији тумора и да може бити потенцијални предиктивни биомаркер код вишеструких карцинома.
У овој студији, користећи ЦРИСПРи функционални скрининг великог обима, утврдили смо да ДАРС-АС1 лнцРНА превазилази стрес ћелија рака регулацијом два кључна одговора на стрес, ПАЦТ и ПКР.Директном интеракцијом са ПАЦТ-ом, ДАРС-АС1 је инхибирао ПАЦТ посредовану активацију ПКР-а, чиме је спречио апоптотичку ћелијску смрт и промовисао ћелијску пролиферацију (слика 5ф).Повећана регулација ДАРС-АС1 је примећена код више врста рака, што сугерише да његова функција промовисања преживљавања ћелија рака у стресним условима може бити широко применљива на више врста рака.
ПАЦТ је идентификован као протеин активатор ПКР, а ПАЦТ посредована активација ПКР игра важну улогу у одговорима на стрес регулацијом транскрипције, транслације, апоптозе и других важних ћелијских процеса62.Деценијама су се покушавали разумети специфична регулација ПАЦТ-ПКР каскаде.Овде је наша студија открила другачији механизам регулације ПАЦТ-ПКР у ћелијама рака кроз ћелијску лнцРНА ДАРС-АС1, која се директно везује за ПАЦТ, блокира ПАЦТ-ПКР интеракцију, инхибира ПКР активацију и фосфорилацију еИФ2α, чиме инхибира апоптозу изазвану стресом и стимулисање евентуалне пролиферације рака.ћелије.Ово откриће баца светло на потенцијалне мете лнцРНА за прогнозу и терапију рака.
Наши подаци су показали да ДАРС-АС1 нокдаун сензибилизира ћелије на гладовање у серуму уз значајно повећање фосфорилисаног ПКР и еИФ2α.Ови резултати сугеришу да ДАРС-АС1 промовише преживљавање ћелија рака у тешким условима тако што инхибира ПАЦТ/ПКР активност.Неколико других некодирајућих РНК, као што су АСПАЦТ и нц886, такође су укључене у ПАЦТ/ПКР осу тако што смањују ПАЦТ48 мРНА или регулишу аутофосфорилацију везивањем за ПКР49,50,64.Међу њима, ДАРС-АС1 делује као ометач ПАЦТ-ПКР асоцијације.Ова студија обогаћује наше разумевање регулације ПАЦТ/ПКР осе и улоге лнцРНА у одговорима на стрес.
ПАЦТ садржи три одвојена домена.Сваки од прва два дсРБД-а је довољан за постизање високог афинитета везивања ПАЦТ-а за ПКР, док је трећи домен (Д3) неопходан за активацију ПКР ин витро и ин виво.Наша студија је показала да ДАРС-АС1 преференцијално реагује са Д3 доменом (слика 3х).С обзиром на велику величину лнцРНА (768 нуклеотида), везивање ДАРС-АС1 за Д3 може физички инхибирати интеракцију између ПАЦТ домена дсРБД и ПКР, чиме се блокира повезивање ПАЦТ и ПКР.ПАЦТ тачкасте мутације које су замениле Сер246 и Сер287 у Д3 са аланином или аспартатом пореметиле су његов афинитет везивања за ДАРС-АС1, указујући на важност укупних структурних и електричних својстава Д3 у њиховој повезаности.Даљи детаљи о овом механизму биће потребни у будућности, користећи прецизнију биохемијску анализу и ПАЦТ структурну анализу високе резолуције.
Претходне студије су известиле да ДАРС-АС1 промовише пролиферацију ћелија кроз неколико механизама51,52,53.У једном примеру, истраживачи су приметили да ДАРС-АС1 појачава регулацију свог антисенс протеина који кодира ДАРС ген циљајући миП-194-5п у ћелије рака бубрега.Међутим, у овој студији, нокдаун ДАРС-АС1 је имао мали утицај на ДАРС транскрипцију код више врста карцинома, укључујући најмање колоректални карцином, рак дојке и јетре.Пошто лнцРНА показују обрасце експресије специфичне за ћелију и ткиво, функционални механизми можда неће бити сачувани у различитим типовима рака, што може допринети овом нескладу између наших запажања и претходних процена различитих карцинома.Потребне су посебне студије да би се разјаснили специфични механизми различитих физиолошких и патолошких процеса.
Анализа клиничких података показала је да је експресија ДАРС-АС1 у туморима у обрнутој корелацији са преживљавањем пацијената оболелих од рака, што указује на значај ДАРС-АС1/ПАЦТ/ПКР осе у прогнози рака.У закључку, наша студија показује да је ДАРС-АС1 регулатор ПАЦТ/ПКР сигналне осе, промовише пролиферацију ћелија рака и инхибира апоптозу током одговора на стрес, што пружа још једну линију истраживања и од интереса је за будућа истраживања потенцијалних третмана .
Људске ћелијске линије СВ620, А549, МБА-МД-231, ХЦТ116, ХепГ2 и ХЕК293Т су добијене од Националне инфраструктуре ћелијских линија у Кини.Све ћелије су одржаване у ДМЕМ медијуму (ДМЕМ, Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА) са додатком 10% ФБС (Гемини, Брооклин, НИ) и 1% пеницилин-стрептомицина (Тхермо Фисхер Сциентифиц) на 37 ° Ц, 5% ЦО2.инкубатор.
Анти-ПАЦТ, Абцам (аб31967);Анти-ПКР, Абцам (аб184257);Анти-ПКР (пхоспхо-Т451), Абцам (аб81303);Анти-Флаг, Абцам (аб125243);Анти-еИФ2α, Абцам (А0764));анти-еИФ2α (фосфор С51), Абцам (аб32157);анти-ПАЦТ (фосфор С246), Абгент (АП7744б);анти-β-тубулин, ЦСТ (2128);нормалан мишји ИгГ, ЦСТ (5415С);нормалан зечји ИгГ, ЦСТ (2729С).Антитела су разблажена 1:1000 у ПБСТ за Вестерн блоттинг и 1:100 за ИП.
сгРНА су развијене коришћењем јавно доступног алата под називом ЦРИСПР-ЕРА66.Користили смо подразумеване параметре алата за развој сгРНА и алгоритам је израчунао места везивања сгРНА у региону од 3 кб.са центром у ТСС.Групе сгРНА олигонуклеотида су синтетизоване у ЦустомАрраи, Инц. (Ботхевелл, ВА) и клониране у хуманизоване пгРНА плазмиде (Аддгене #44248).Укупно 12 µг удруженог хуманизованог пгРНА плазмида, 7,2 µг псПАКС2 (Аддгене #12260) и 4,8 µг пМД2.Г (Аддгене #12259) је ко-трансфектовано у 5 к 106 ХЕК293Т ХЕК293Т дифузије користећи ДНАфе цм трансфецтиве. ћелије (ЦВБИО, Пекинг, Кина) пратећи упутства произвођача.Супернатанти који садрже вирус су сакупљени 48 и 72 сата након трансфекције и филтрирани кроз филтер од 0,45 µм.За скрининг, СВ620 ћелије које експримирају дЦас9/КРАБ фузиони протеин су добијене трансдукцијом вируса.Модификоване ћелије СВ620 су инфициране библиотеком вируса у четири независна експеримента инфекције при МОИ од 0,1-0,3 и узорковане су са 2 μг/мл пуромицина (Сигма, Ст. Лоуис, МО) током 2 дана.Након тога, ћелије су култивисане 18 дана ин витро са минималном покривеношћу библиотеке од 500 ћелија/сгРНА за скрининг.
Геномска ДНК је екстрахована према упутствима КИАамп ДНК Блоод Миди комплета (КИАГЕН, Дизелдорф, Немачка; 51183).Укупно, 100 μг геномске ДНК по биолошком понављању је коришћено за изградњу библиотеке.Регион сгРНА је амплификован са два круга ПЦР-а и повезан са бар кодом.
ПЦР производи су пречишћени коришћењем НуцлеоСпин® гела и ПЦР комплета за пречишћавање (МАЦХЕРЕИ-НАГЕЛ, Дурен, Немачка; 740609.250) и квантификовани коришћењем Кубит™ ХС дволанчаног ДНК комплета за детекцију (Тхермо Фисхер Сциентифиц; К32854).
МТС тест је коришћен за мерење пролиферације ћелија.Ћелије су засејане у плоче са 96 јажица при почетној густини од 2000 ћелија/бунарићу.Релативни број ћелија је мерен дневно у назначено време током укупно 4-6 дана.За сваки бунар, 20 μл МТС реагенса (Промега) је разблажено са 100 μл ДМЕМ, инкубирано са ћелијама 4 х на 37 ° Ц, а затим је измерен ОД490.
Капацитет неусидреног раста откривен је анализом формирања сфера.Укратко, 2000 ћелија трансфицираних са схРНА ДАРС-АС1 или контролном схРНА култивисано је у микроплочама са ултра ниским причвршћивањем (Цорнинг) са променом медија свака 4 дана.Сфероиди су пребројани након 14 дана.500 ћелија трансфектованих ДАРС-АС1 плазмидом прекомерне експресије или контролним плазмидом коришћено је за тест побољшања, у супротном метода је била непромењена.
РНК је транскрибована коришћењем Т7 РНК полимеразе и биотин-16-УТП (Роцхе 1138908910) према упутствима Рибопробе® Цомбинатион Системс (Промега П1440).Прајмери ​​који се овде користе наведени су у додатној табели 4.
ПАЦТ или ПКР региони који кодирају протеин клонирани су у пЕТ15б (Аддгене #73619) и трансформисани у БЛ21 (ДЕ3).Бактерије су инкубиране преко ноћи у ЛБ са ампицилином, а затим разблажене 100 пута са свежим ЛБ.Када је ОД600 медијума достигао 0,8, додат је 1 мМ ИПТГ да би се индуковала експресија протеина.После инкубације преко ноћи уз лагано мућкање (250 рпм на 20°Ц), ћелијска пелета је сакупљена центрифугирањем (4000 рпм, 10 мин, 4°Ц).Ресуспендујте ћелијску пелету у пуферу за лизу (50 мМ Трис, пХ 8,0, 250 мМ НаЦл, 1 мМ ПМСФ) и инкубирајте на леду 30 минута, затим соникирајте (15 минута, 5 с укључено/искључено, на леду) и центрифугирајте (13 000 рпм).30 мин, 4°С).Супернатант је затим стављен на Ни-НТА смолу (КИАГЕН) 3 пута на 4°Ц, испран 4 пута пуфером за испирање (50 мМ Трис, пХ 8,0, 40 мМ имидазола, 250 мМ НаЦл) и елуиран 3 пута, са укупним од 10 мл елуентног пуфера (50 мМ Трис, пХ 8,0, 250 мМ НаЦл, 300 мМ имидазола).Пречишћени протеин је одређен коришћењем ВБ и концентрација је одређена коришћењем Кубит™ комплета за анализу протеина (Тхермо Фисхер Сциентифиц; К 33212).
РИП тестови су изведени као што је претходно описано, са модификацијама.Укратко, 1к РИП пуфер (25 мМ Трис-ХЦл, пХ 7,5, 100 мМ НаЦл, 0,5% НП-40, РНасин инхибитор рибонуклеазе (Промега), ПМСФ (Беиотиме Биотецхнологи), 1 мМ ДДМ, протеаза) лизира ко1 к10 цитостатик (Роцхе, 1 мМ ДТТ) и центрифугирајте на 13.000 рпм током 15 минута на 4 ° Ц.Супернатант је затим инкубиран са протеинским А+Г магнетним куглицама (Миллипоре) коњугованим са 5 μг анти-ПАЦТ антитела (Абеам) или ИгГ (ЦСТ).Зрнца су испрана 5 пута са 5к РИП пуфером, затим дигестирана протеиназом К (НЕБ).РНК је екстрахована са Тризолом и одређена помоћу РТ-кПЦР.Прајмери ​​су представљени у додатној табели 5.
Ин витро РИП тест је изведен према модификованом стандардном протоколу РИП теста.Укупно 5 пмол ин витро транскрибоване РНК је разблажено 1к са РИП пуфером и жарено инкубацијом на 65°Ц током 5 минута, након чега је уследило споро хлађење до собне температуре.Укупно 5 пмол интактних или мутираних ПАЦТ протеина обележених заставицом је пречишћено из Е. цоли.Инкубирајте са ренатурисаном РНК 2 сата на 4°Ц и следите горњу процедуру за РИП анализу за анти-флаг ИП.
За анализу проширења РНК, 1×107 ћелија је лизирано са 1кРИП пуфером.После центрифугирања на 13.000 рпм током 15 минута на 4 ° Ц, супернатант је претходно третиран са 30 μл магнетних перли стрептавидина (Бецкман) током 2 х на 4 ° Ц.Пречишћени лизат је затим снабдевен тРНК квасца и инкубиран са 40 пмол ренатурисане РНК преко ноћи на 4 ° Ц, затим још 2 сата и додато је 20 μл нових стрептавидин магнетних перли блокираних БСА.Корак прања се састојао од 4 пута са 5к РИП пуфером и 4 пута са 1к РИП пуфером.Одговарајући протеини су елуирани биотинским пуфером за елуирање (25 мМ Трис-ХЦл, пХ 7,5, 12,5 мМ Д-биотин, ПМСФ) и раздвојени на НуПАГЕ 4-12% Бис-Трис гелу (Инвитроген).Након бојења сребром (Беиотиме Биотецхнологи), одређене траке су изрезане и анализиране помоћу МС.
Цо-ИП анализа је извршена да би се тестирала интеракција између ПАЦТ-а и ПКР-а.Укратко, супернатантни лизати су припремљени инкубацијом 1 к 107 лизираних ћелија у 1 к РИП пуферу након чега је уследило центрифугирање на 13.000 рпм током 15 минута на 4°Ц.Лизати су напуњени магнетним куглицама протеина А + Г, коњуговане са 5 µг анти-ПАЦТ антитела и лагано ротиране преко ноћи на 4°Ц.Перле су испране 3 пута са 5×РИП пуфером, два пута са 1×РИП пуфером и елуиране са 1×СДС пуфером.Добијени протеин је анализиран помоћу СДС-ПАГЕ гела и детектован помоћу ВБ.
Два пмол означеног ПАЦТ и 1 пмол ПКР су пречишћени из Е. цоли.Разблажити у 1× РИП пуферу и инкубирати са 10 пмол ренатурисане РНК током 2 сата на 4 °Ц.Након тога, они су инкубирани са анти-обележеним антителом коњугованим са протеином А+Г магнетном куглом још два сата.Перле су затим опране четири пута са 1к РИП пуфером и елуиране са 1к СДС пуфером.Добијени ПАЦТ и ПКР су детектовани од стране ВБ.